Улучшение 3D гидрогеля культур первичных глиальных клеток In Vitro моделирования Neuroinflammation
8 декабря 2017 г.
Здесь мы представляем протокол для 3D культуре крысы клеток мозга, полученных глии, включая астроциты, Микроглия и олигодендроциты. Мы демонстрируем культуры главной ячейки, гидрогеля синтез methacrylated гиалуроновой кислоты (HAMA), HAMAphoto полимеризации и ячейки инкапсуляции и образец обработки для конфокальных и сканирования электрона микроскопических изображений.
Общей целью данного протокола 3D-культивирования клеток является моделирование события глиального рубца центральной нервной системы с использованием ключевых индикаторных клеток: микроглии, астроцитов и олигодендроцитов. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейровоспаления, такие как потенциал глиальных клеток для усиления регенеративных стратегий и раскрытия глиального рубца. Основное преимущество этой методики заключается в том, что глиальная биология может быть быстро охарактеризована в 3D-микросреде с помощью систематических и сквозных манипуляций. Чтобы подготовить покровные листки для посева, начните с добавления одного миллилитра 3-пропилметакрилата в 49 миллилитров дистиллированной воды, чтобы получился 2%-ный раствор. Затем поместите в раствор 18-миллиметровую стеклянную крышку и покачивайте в течение часа при комнатной температуре. Через час промойте покровные стекла, последовательно опустив каждый покровный лист в три стакана по 100 миллилитров деионизированной воды. Затем просушите крышку в вакууме с помощью эксикатора и духовке при температуре 40 градусов Цельсия на ночь. На следующий день с помощью щипцов быстро погрузите отдельные покровные листы в 70% этанол. Затем, не высыхая, опустите каждую крышку в лунку 12-луночной пластины. Далее промойте каждую лунку одним миллилитром стерильной деионизированной воды. Затем добавьте один миллилитр стерильного поли
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен протокол трехмерного (3D) культивирования глиальных клеток головного мозга крысы, включая астроциты, микроглию и олигодендроциты. Подробно описаны процессы первичного культивирования клеток, синтеза гидрогеля и методы визуализации.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Нейробиология
- Клеточная биология
- Тканевая инженерия
Теоретическая часть
- Системы 3D-культивирования клеток необходимы для изучения глиальных клеток.
- Глиальные клетки, полученные из мозга крысы, играют важную роль в нейробиологии.
- Гидрогели обеспечивают поддерживающую среду для роста клеток.
- Методы визуализации имеют жизненно важное значение для анализа морфологии клеток.
Цель исследования
- Разработать надежный протокол для культивирования глиальных клеток в 3D.
- Углубить понимание взаимодействий глиальных клеток.
- Обеспечить возможность применения передовых методов визуализации культивируемых клеток.
Используемые методы
- Первичная культура глиальных клеток головного мозга крысы.
- Синтез гидрогеля на основе метакрилированной гиалуроновой кислоты (HAMA).
- Фотополимеризация HAMA для инкапсуляции клеток.
- Подготовка образцов для конфокальной и сканирующей электронной микроскопии.
Основные результаты
- Успешное инкапсулирование глиальных клеток в гидрогель HAMA.
- Подтвержденная жизнеспособность и функциональность культивируемых клеток.
- Получены высококачественные изображения морфологии клеток.
- Данный протокол служит основой для будущих исследований глиальных клеток.
Выводы
- Разработанный протокол эффективен для 3D-культивирования глиальных клеток.
- Данный метод может быть применен в различных областях нейробиологических исследований.
- Будущие исследования могут опираться на эту основу для проведения более углубленного изучения.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Моделирование нейровоспалительных процессов в физиологически релевантной 3D-среде позволяет снизить механистические риски при разработке препаратов, нацеленных на глию. Данный подход повышает прогностическую достоверность валидации мишеней за счет воспроизведения процесса формирования глиального рубца — ключевого патологического признака при повреждениях ЦНС и нейродегенерации. Метод обеспечивает трансляционную преемственность от этапа поиска до доклинической оценки, предоставляя релевантную модели заболевания систему для скрининга иммуномодулирующих соединений.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать взаимодействия глиальных клеток в 3D-микроокружении для выяснения патогенных механизмов нейровоспаления.
- Практическая ценность: обеспечивает функциональную валидацию микроглии, астроцитов и олигодендроцитов в качестве терапевтических мишеней при заболеваниях ЦНС.
- Прогностическая ценность: повышает уверенность в выборе мишени за счет моделирования формирования глиального рубца — ключевого фактора цитотоксичности и нарушения регенерации.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: обеспечивает стандартизированную воспроизводимую платформу для подготовки гидрогелей с глиальными клетками для скрининга соединений.
- Практическая ценность: позволяет проводить количественную оценку ответов глии с помощью конфокальной и СЭМ-визуализации, что подтверждает готовность анализа.
- Масштабируемость: совместимость с высокопроизводительными методами манипулирования и модификацией биоактивного субстрата для оптимизации анализа.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная непрерывность: обеспечивает связь между фундаментальными исследованиями и доклиническим этапом путем моделирования релевантной для заболевания системы формирования глиального рубца.
- Механистическое снижение рисков: позволяет оценить влияние соединений на активацию глии и созревание рубца, что способствует принятию обоснованных решений при переходе к следующим этапам разработки.
- Согласование биомаркеров: позволяет оценивать морфологию и реактивность глии в качестве трансляционных биомаркеров нейровоспалительного ответа.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод интегрируется в континуум поиска новых лекарственных средств — от валидации мишени и идентификации ведущих соединений до доклинических исследований — путем создания системы 3D-культивирования глии, которая моделирует нейровоспалительную патологию.
- Фундаментальная биология: Обеспечивает проверку гипотез о глиальных воспалительных путях и межклеточном взаимодействии в биомиметической среде.
- Скрининг: Позволяет стандартизировать анализ и получать количественные показатели для оценки иммуномодулирующего воздействия на фенотип и функции глии.
- Аналитика: Обеспечивает получение изображений высокого разрешения с помощью конфокальной и сканирующей электронной микроскопии для количественной оценки морфологии, распределения и состояний активации клеток.
- Трансляционные исследования: Связывает раннюю модуляцию глиальных мишеней с доклиническими результатами путем воспроизведения ключевого патологического процесса при повреждениях и заболеваниях ЦНС.
- Корпоративное повторное использование: Создает универсальную платформу на основе гидрогеля для моделей хронического и острого нейровоспаления в рамках различных исследовательских проектов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышение прогностической достоверности валидации мишеней за счет понимания механизмов формирования глиального рубца и нейровоспалительных каскадов.
- Операционная ценность: Стандартизация, воспроизводимость и масштабируемость 3D-культур глии для обеспечения согласованности экспериментов между различными исследовательскими группами.
- Стратегическая ценность: Оптимизация принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) за счет снижения биологической неопределенности при взаимодействии с глиальными мишенями и модуляции путей передачи сигнала.
- Влияние на портфель: Приоритизация терапевтических средств для ЦНС с учетом рисков на основе эффективности модуляции глиальных ответов в системе, релевантной заболеванию.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области выделения первичных глиальных клеток, синтеза гидрогелей и методов 3D-культивирования.
- Оборудование включает системы УФ-фотополимеризации, конфокальные микроскопы и сканирующие электронные микроскопы для проведения анализа характеристик.
- Стандартизация между исследовательскими группами требует единообразия состава гидрогеля, плотности посева клеток и протоколов визуализации.
- Адаптация к другим источникам глиальных клеток или моделям заболеваний может потребовать оптимизации жесткости гидрогеля и биоактивного покрытия.
- Практические ограничения включают вариабельность выхода первичных клеток и необходимость соблюдения правил асептики на этапах инкапсуляции и полимеризации.
