Иммунофлуоресценции γH2AX и 53BP1 для анализа формирования и ремонт двухнитевые разрывы ДНК

Общей целью иммунофлуоресцентной микроскопии гамма-H2AX и 53BP1 является анализ образования и репарации двухцепочечных разрывов ДНК в различных тканях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в исследованиях рака, например, как возникает генетическая нестабильность в опухолевых клетках. Основное преимущество этого метода заключается в том, что можно визуализировать разрывы одиночной ДНК с двумя нитями, а также проанализировать процессы репарации.

Демонстрировать процедуру будет Сюзанна Брендель, техник нашей лаборатории. Начните эксперимент с приготовления растворов, начиная с стоечного раствора антикоагулянта с 200 международными единицами гепарина на миллилитр в 0,9% хлорида натрия. Заполните каждую из пробирок для сбора двумя миллилитрами стокового раствора антикоагулянта перед забором образцов крови или костного мозга.

Затем приготовьте раствор 10X Lysis для эритроцитов с 82,91 граммами хлорида аммония, 7,91 граммами бикарбоната аммония и двумя миллилитрами 0,5 молярного раствора этилендиаментетрацетрадиновой кислоты до pH 8,0, растворив агенты в дважды дистиллированной воде на общий объем один литр. Затем приготовьте фиксирующий раствор, добавив 8,3 микролитра одного молярного раствора гидроксида калия к 360 миллиграммам параформальдегида, или ПФА, в микротитровую пробирку. Заполните трубку фосфатно-соевым буфером (PBS) до отметки в один миллилитр трубки и нагрейте трубку в нагревательном блоке при температуре 95 градусов Цельсия, чтобы получить один миллилитр 36-процентного раствора PFA.

Перелейте один миллилитр 36-процентного раствора PFA в 15-миллилитровую трубку. И добавьте восемь миллилитров PBS, чтобы получить девять миллилитров четырехпроцентного исходного раствора PFA. Возьмите четырехпроцентный исходный раствор PFA и храните его при температуре минус 18 градусов Цельсия до использования для фиксации клеток.

Затем готовят раствор для пермеабилизации, добавляя от 50 микролитров октоксинола 9 до 50 миллилитров PBS для получения раствора примерно 0,1% октоксинола 9. Наконец, приготовьте пятипроцентные и двухпроцентные блокирующие растворы, смешав блокатор белка с PBS. Чтобы подготовить образцы крови или костного мозга, извлеките пробирки, наполненные двумя миллилитрами стокового раствора антикоагулянта.

Изымайте семь миллилитров крови или костного мозга в пробирке в стерильных условиях с помощью венепункции или пункции костного мозга соответственно. Храните образцы в течение ночи при комнатной температуре. После хранения в течение ночи образец гепаринизированной крови развести один к одному с PBS и образец гепаринизированного костного мозга в соотношении один к трем с PBS.

Осторожно подвешивайте клетки, дважды втягивая их в пипетку и вынимая из нее. Далее добавьте один объем градиента плотности среды в свежую пробирку. Аккуратно нанесите разбавленную кровь или костный мозг поверх градиентной среды плотности и следите за тем, чтобы не перепутать два слоя.

Центрифугируйте пробирку в течение 30 минут при комнатной температуре и 400 G. Снимите верхний слой плазмы с помощью пипетки. Затем осторожно соберите мононуклеарные ячейки в слое над средой градиента плотности. Переложите мононуклеарные элементы в новую пробирку и добавьте не менее трех объемов PBS.

Осторожно подвешивайте клетки, дважды втягивая их в пипетку и вынимая из нее. Центрифугируйте пробирку. После отжима удалите надосадочную жидкость.

Добавьте 10 миллилитров четырех градусов Цельсия 1x Лизис раствор для эритроцитов. Осторожно восстановите ячейки, дважды втягивая их в пипетку и вынимая из нее, и поместите пробирку на лед на пять минут. Затем добавьте 30 миллилитров PBS при четырех градусах Цельсия и центрифугируйте пробирку.

Используйте микрогранулы CD34 и колонки для разделения клеток для выделения CD34-положительных клеток. Приготовьте два цитоспина с мононуклеарными клетками образцов пациента путем центрифугирования один раз по 10 пяти клеток для каждого препарата. Зафиксируйте клетки 200 микролитрами четырехпроцентного PFA на 10 минут.

После фиксации аккуратно трижды промойте клетки 30 миллилитрами PBS по пять минут каждая на шейкере. Затем пропитайте клетки 200 микролитрами 0,1% октоксинола 9 в течение 10 минут. Аккуратно промойте клетки три раза 30 миллилитрами пятипроцентного блокирующего раствора в течение пяти минут каждая на лабораторном шейкере.

Заблокируйте клетки в 30 миллилитрах свежего пятипроцентного раствора для блокировки на один час. Фиксация и проникновение в клетки 4% параформальдегида в 0,1% октоксинола 9 четко сохраняет очаги гамма-H2AX и 53BP1. Инкубируют один препарат клеток с мышиным моноклональным антителом против гамма-H2AX, а другой препарат клеток с мышиным моноклональным антителом против гамма-H2AX и поликлональным кроличьим антителом против 53BP1 в течение ночи при четырех градусах Цельсия.

Настоятельно рекомендуется использовать проверенные антитела против гамма-H2AX и анти-53BP1. После инкубации аккуратно промойте клетки три раза 30 миллилитрами двухпроцентного блокирующего раствора в течение каждых пяти минут на лабораторном шейкере. Затем инкубируют первый препарат клеток с конъюгированным козьим вторичным антителом против мышей Alexa 488, разведенным один к 500 в двухпроцентном блокирующем растворе.

Инкубируют второй препарат клеток с конъюгированным козьим вторичным антителом против мыши Alexa 488 и конъюгированным вторичным антителом против кролика Alexa 555, разведенным один из 500 в двухпроцентный блокирующий раствор. Аккуратно промойте клетки три раза 30 миллилитрами PBS на лабораторном шейкере. Снимите PBS и установите элементы с монтажным материалом.

Осторожно наденьте крышку сверху на монтажную среду, чтобы в нее не застряли пузырьки воздуха. Подождите не менее трех часов, пока монтажная среда затвердеет, прежде чем анализировать клетки с помощью флуоресцентной микроскопии. Наконец, проанализируйте очаги гамма-H2AX и 53BP1 в ядрах клеток с помощью флуоресцентного микроскопа, оснащенного фильтрами для DAPI, Alexa 488 и Cy3 во время визуализации при 100-кратном увеличении объекта.

Анализ очагов гамма-H2AX в клетках наиболее точен в фазе G0 G1 и фазе G2, когда очаги гамма-H2AX проявляются в виде отчетливых флуоресцентных точек, как показано на этом репрезентативном изображении фибробластов. Напротив, анализ очагов гамма-H2AX в клетках во время S-фазы осложняется дисперсными панядерными пятнышками гамма-H2AX, вызванными процессом репликации. Иммунофлуоресцентное окрашивание гамма-H2AX было использовано для количественного определения двухцепочечных разрывов ДНК в облученных тканях и показало, что уровни очагов гамма-H2AX в облученных лимфоцитах пропорциональны дозе облучения.

Ко-локализация очагов гамма-H2AX и 53BP1 в CD34-положительных клетках пациента с острым миелоидным лейкозом указывает на активацию 53BP1-опосредованных негомологичных механизмов репарации концевых соединений в местах двухцепочечных разрывов ДНК. После этого просмотра данного видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить иммунофлуоресцентную микроскопию гамма-H2AX и 53BP1 для анализа двухцепочечных разрывов ДНК. После этой процедуры в опухолевых клетках могут быть выполнены другие методы, такие как иммуноблоттинг ассоциированных с фосфором ATM, ATR, киназы первого контрольного пункта, киназы второго контрольного пункта и TP53 с целью анализа изменений ответа на повреждение ДНК.