Изготовление пользовательских агарозы скважин для заполнения клеток и тканей кольцо самостоятельной сборки с использованием 3D-печатные формы

Общая цель этой процедуры заключается в создании нестандартных форм для затравки клеток, которые используются для изготовления самособирающихся тканевых колец различных размеров. Этот метод позволяет нам создавать трехмерные тканевые кольца из клеток человека, которые могут быть использованы для оценки структуры, прочности и функции ткани. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он представляет собой простой метод изготовления форм для самостоятельно собирающихся тканей с нестандартными размерами.

Чтобы начать процедуру, используйте программное обеспечение для автоматизированного проектирования для создания чертежа пресс-формы в желаемых размерах. Отправьте файл САПР на 3D-принтер с высоким разрешением. Напечатайте форму в пластике с глянцевым покрытием, стабильным при температуре 50 градусов по Цельсию.

Тщательно вымойте напечатанную форму с помощью щетки, моющего средства и воды. Промойте форму дистиллированной водой и дайте ей высохнуть на воздухе в решетке. Важно выбрать пластик, напечатанный на 3D-принтере, который стабилен при температуре отверждения PDMS.

Остатки, которые попадают на PDMS во время нагрева, могут повлиять на образование колец. Далее отмерьте 25 грамм основания PDMS в одноразовой лодке для взвешивания. Добавьте отвердитель в соотношении 1:10 по весу и энергично перемешайте, пока основа и отвердитель полностью не перемешаются.

Затем закрепите лабораторный скотч по бокам формы, чтобы сформировать стену высотой около одного сантиметра вокруг лицевой стороны с напечатанными лунками. Убедитесь, что в стене ленты нет зазоров. Залейте смесь PDMS в напечатанную на 3D-принтере форму.

Дегазируйте PDMS в вакуумной камере в течение 30–60 минут или до тех пор, пока не останутся пузырьки. Отверждайте PDMS при температуре 50 градусов Цельсия в течение двух-четырех часов или до тех пор, пока PDMS не станет достаточно твердым, чтобы его можно было извлечь из формы. Затем снимите ленту и осторожно отделите негатив PDMS от формы.

Инкубируйте отрицательный PDMS в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение одного часа, чтобы убедиться, что он полностью отверждается. Затем тщательно промойте негатив с помощью моющего средства и воды. Промойте форму дистиллированной водой и дайте ей высохнуть на воздухе.

Перед изготовлением агарозной формы автоклавируйте негатив PDMS, пару тупых щипцов и любые другие желаемые инструменты. Чтобы начать изготовление, подготовьте и автоклавируйте не менее 50 миллилитров двухпроцентной агарозы в DMEM. Подготовьте агарозные лунки за сутки до кольцевого посева.

Пипеткой внесите четыре миллилитра расплавленного агароза в автоклавный негатив PDMS, стараясь не переполнить форму. Затем пипеткой впрыскиваем расплавленную агарозу в полости для столбов агарозного колодца. Используйте наконечник для дозатора для удаления всех пузырьков воздуха.

Итоговая поверхность агарозы должна быть ровной. Дайте агарозе остыть около 10 минут. Затем с помощью тупых щипцов осторожно отделите остывшую агарозную форму от негатива PDMS.

Поместите форму лицевой стороной вверх в одну лунку шестилуночной пластины. Добавьте в лунку для тарелки соответствующую готовую питательную среду так, чтобы агарозные лунки были полностью погружены. Уравновесьте агарозные лунки при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи перед использованием.

Во-первых, в 15-сантиметровой чашке для культивирования культивируйте гладкомышечные клетки аорты крысы при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере с 5-процентным содержанием углекислого газа до тех пор, пока не будет достигнуто 70-процентное слияние. После того, как желаемая агарозная плесень будет подготовлена и уравновешена в течение ночи, дважды промойте чашку для культуры пятью миллилитрами фосфатно-солевого буфера. После удаления PBS добавьте в блюдо три миллилитра 0,25-процентного триппина.

Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-трех минут или до тех пор, пока клетки не поднимутся из чашки. Нейтрализуйте трипзин тремя миллилитрами полной питательной среды. Переложите клетки в коническую трубку и аккуратно пипетируйте клетки до полного ресуспензирования.

Разведите аликват клеточной суспензии с равным объемом трипанового синего красителя, и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Затем центрифугируйте суспензию при 200-кратном перегрузке в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в полной питательной среде до достижения концентрации 10 миллионов клеток на миллилитр.

Наиболее важными шагами для обеспечения стабильного формирования колец являются оптимизация количества клеток и питательной среды для используемой клеточной линии. Далее получают уравновешенные агарозные лунки. Тщательно отсасывайте всю среду как вокруг внешней стороны агарозы, так и внутри агарозных лунок, стараясь не проколоть дно лунок.

Пипеткой внесите по 50 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку. Добавьте два миллилитра свежей среды вокруг внешней стороны агарозных лунок, не позволяя среде вылиться в лунки. Инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере с пятипроцентным содержанием CO2, чтобы позволить клеткам агрегироваться.

Затем аспирируйте среду извне агарозы. Хорошо добавьте в тарелку 4,5 миллилитра свежей среды так, чтобы агарозные лунки заполнились и вся агарозная форма была полностью погружена. Продолжайте инкубацию планшета до тех пор, пока тканевые кольца не разовьются достаточно, заменяя среду каждый день.

Затем аккуратно сдвиньте каждое тканевое кольцо с его поста с помощью щипцов. Немедленно либо зафиксируйте кольца для гистологии, либо используйте кольца для функциональной или механической оценки. 3D-печать позволила сделать конструкцию пресс-форм более гибкой.

Диаметры столбов можно было легко варьировать, как было показано на моих кольцах гладкомышечных клеток крысы, изготовленных вокруг столбов диаметром два, четыре и двенадцать миллиметров. Тканевые кольца также были получены из первичных человеческих SMC, человеческих мезенхимальных стволовых клеток и SMC, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Кольца использовались в качестве моделей тканей in vitro для оценки функции тканей и механической прочности.

Хотя этот метод был первоначально разработан для изготовления и моделирования сосудистой ткани, он также может быть использован для изготовления сегментов других типов тканей, таких как хрящи, скелетные мышцы и сердечная ткань. Этот метод предоставляет исследователям простой способ создания пользовательских форм для изготовления 3D-тканевых колец различных размеров. Эти кольца могут быть использованы для оценки структуры, механических свойств и функций сконструированных тканей, изготовленных из различных типов клеток.