Изготовление пользовательских агарозы скважин для заполнения клеток и тканей кольцо самостоятельной сборки с использованием 3D-печатные формы
2 апреля 2018 г.
Этот протокол описывает платформу для изготовления колец собственн-собранные ткани в переменной размеров с помощью заказной 3D-печати прессформа. Негативы PDMS лечатся в 3D-печатные формы; затем агарозы приведен в вылечить PDMS негативов. Клетки посеяны в результате агарозы скважин, где они вычисляются в ткани кольца.
Общая цель этой процедуры заключается в создании нестандартных форм для затравки клеток, которые используются для изготовления самособирающихся тканевых колец различных размеров. Этот метод позволяет нам создавать трехмерные тканевые кольца из клеток человека, которые могут быть использованы для оценки структуры, прочности и функции ткани. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он представляет собой простой метод изготовления форм для самостоятельно собирающихся тканей с нестандартными размерами.
Чтобы начать процедуру, используйте программное обеспечение для автоматизированного проектирования для создания чертежа пресс-формы в желаемых размерах. Отправьте файл САПР на 3D-принтер с высоким разрешением. Напечатайте форму в пластике с глянцевым покрытием, стабильным при температуре 50 градусов по Цельсию.
Тщательно вымойте напечатанную форму с помощью щетки, моющего средства и воды. Промойте форму дистиллированной водой и дайте ей высохнуть на воздухе в решетке. Важно выбрать пластик, напечатанный на 3D-принтере, который стабилен при температуре отверждения PDMS.
Остатки, которые попадают на PDMS во время нагрева, могут повлиять на образование колец. Далее отмерьте 25 грамм основания PDMS в одноразовой лодке для взвешивания. Добавьте отвердитель в соотношении 1:10 по весу и энергично перемешайте, пока основа и отвердитель полностью не перемешаются.
Затем закрепите лабораторный скотч по бокам формы, чтобы сформировать стену высотой около одного сантиметра вокруг лицевой стороны с напечатанными лунками. Убедитесь, что в стене ленты нет зазоров. Залейте смесь PDMS в напечатанную на 3D-принтере форму.
Дегазируйте PDMS в вакуумной камере в течение 30–60 минут или до тех пор, пока не останутся пузырьки. Отверждайте PDMS при температуре 50 градусов Цельсия в течение двух-четырех часов или до тех пор, пока PDMS не станет достаточно твердым, чтобы его можно было извлечь из формы. Затем снимите ленту и осторожно отделите негатив PDMS от формы.
Инкубируйте отрицательный PDMS в духовке при температуре 60 градусов Цельсия в течение одного часа, чтобы убедиться, что он полностью отверждается. Затем тщательно промойте негатив с помощью моющего средства и воды. Промойте форму дистиллированной водой и дайте ей высохнуть на воздухе.
Перед изготовлением агарозной формы автоклавируйте негатив PDMS, пару тупых щипцов и любые другие желаемые инструменты. Чтобы начать изготовление, подготовьте и автоклавируйте не менее 50 миллилитров двухпроцентной агарозы в DMEM. Подготовьте агарозные лунки за сутки до кольцевого посева.
Пипеткой внесите четыре миллилитра расплавленного агароза в автоклавный негатив PDMS, стараясь не переполнить форму. Затем пипеткой впрыскиваем расплавленную агарозу в полости для столбов агарозного колодца. Используйте наконечник для дозатора для удаления всех пузырьков воздуха.
Итоговая поверхность агарозы должна быть ровной. Дайте агарозе остыть около 10 минут. Затем с помощью тупых щипцов осторожно отделите остывшую агарозную форму от негатива PDMS.
Поместите форму лицевой стороной вверх в одну лунку шестилуночной пластины. Добавьте в лунку для тарелки соответствующую готовую питательную среду так, чтобы агарозные лунки были полностью погружены. Уравновесьте агарозные лунки при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи перед использованием.
Во-первых, в 15-сантиметровой чашке для культивирования культивируйте гладкомышечные клетки аорты крысы при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере с 5-процентным содержанием углекислого газа до тех пор, пока не будет достигнуто 70-процентное слияние. После того, как желаемая агарозная плесень будет подготовлена и уравновешена в течение ночи, дважды промойте чашку для культуры пятью миллилитрами фосфатно-солевого буфера. После удаления PBS добавьте в блюдо три миллилитра 0,25-процентного триппина.
Инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух-трех минут или до тех пор, пока клетки не поднимутся из чашки. Нейтрализуйте трипзин тремя миллилитрами полной питательной среды. Переложите клетки в коническую трубку и аккуратно пипетируйте клетки до полного ресуспензирования.
Разведите аликват клеточной суспензии с равным объемом трипанового синего красителя, и подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра. Затем центрифугируйте суспензию при 200-кратном перегрузке в течение пяти минут. Удалите надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клетки в полной питательной среде до достижения концентрации 10 миллионов клеток на миллилитр.
Наиболее важными шагами для обеспечения стабильного формирования колец являются оптимизация количества клеток и питательной среды для используемой клеточной линии. Далее получают уравновешенные агарозные лунки. Тщательно отсасывайте всю среду как вокруг внешней стороны агарозы, так и внутри агарозных лунок, стараясь не проколоть дно лунок.
Пипеткой внесите по 50 микролитров клеточной суспензии в каждую лунку. Добавьте два миллилитра свежей среды вокруг внешней стороны агарозных лунок, не позволяя среде вылиться в лунки. Инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия в атмосфере с пятипроцентным содержанием CO2, чтобы позволить клеткам агрегироваться.
Затем аспирируйте среду извне агарозы. Хорошо добавьте в тарелку 4,5 миллилитра свежей среды так, чтобы агарозные лунки заполнились и вся агарозная форма была полностью погружена. Продолжайте инкубацию планшета до тех пор, пока тканевые кольца не разовьются достаточно, заменяя среду каждый день.
Затем аккуратно сдвиньте каждое тканевое кольцо с его поста с помощью щипцов. Немедленно либо зафиксируйте кольца для гистологии, либо используйте кольца для функциональной или механической оценки. 3D-печать позволила сделать конструкцию пресс-форм более гибкой.
Диаметры столбов можно было легко варьировать, как было показано на моих кольцах гладкомышечных клеток крысы, изготовленных вокруг столбов диаметром два, четыре и двенадцать миллиметров. Тканевые кольца также были получены из первичных человеческих SMC, человеческих мезенхимальных стволовых клеток и SMC, полученных из индуцированных плюрипотентных стволовых клеток. Кольца использовались в качестве моделей тканей in vitro для оценки функции тканей и механической прочности.
Хотя этот метод был первоначально разработан для изготовления и моделирования сосудистой ткани, он также может быть использован для изготовления сегментов других типов тканей, таких как хрящи, скелетные мышцы и сердечная ткань. Этот метод предоставляет исследователям простой способ создания пользовательских форм для изготовления 3D-тканевых колец различных размеров. Эти кольца могут быть использованы для оценки структуры, механических свойств и функций сконструированных тканей, изготовленных из различных типов клеток.
Обзор
В данном протоколе описывается метод создания самоорганизующихся тканевых колец различных размеров с использованием специально разработанной 3D-печатной формы. Процесс включает изготовление негативов из PDMS и заливку агарозы для создания лунок для агрегации клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Тканевая инженерия
- Культивирование клеток
- 3D-печать
Теоретические основы
- Самоорганизующиеся тканевые кольца могут быть использованы для изучения структуры и функций тканей.
- 3D-печать позволяет создавать индивидуальные формы для литья.
- Данный метод может быть применен к различным типам тканей, включая сосудистые ткани и ткани сердца.
- Оптимизация количества клеток и условий культивирования имеет решающее значение для успешного формирования тканевых колец.
Цель исследования
- Разработать простой метод изготовления тканевых колец заданных размеров.
- Оценить механические свойства и функциональность сконструированных тканей.
- Создать платформу для изучения различных типов клеток в области тканевой инженерии.
Используемые методы
- Проектирование форм с помощью программного обеспечения CAD и их 3D-печать из стабильного пластика.
- Создание негативов из PDMS и агарозных лунок для посева клеток.
- Посев клеток в агарозные лунки и обеспечение их агрегации в тканевые кольца.
- Оценка структурных и функциональных свойств сформированных тканевых колец.
Основные результаты
- Тканевые кольца были успешно сформированы из различных типов клеток, включая гладкомышечные клетки человека.
- Метод продемонстрировал гибкость в проектировании форм и изготовлении тканей.
- Кольца использовались для оценки функции ткани и ее механической прочности in vitro.
- Различные размеры тканевых колец были достигнуты путем изменения диаметров стержней в формах.
Выводы
- Данный протокол представляет собой простой и эффективный способ создания специализированных тканевых колец.
- Он может быть адаптирован для различных применений в области тканевой инженерии.
- Этот метод расширяет возможности изучения инженерных тканей и их свойств.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для промышленности
Данный метод позволяет научно-исследовательским группам в области биофармацевтики создавать настраиваемые бескаркасные тканевые кольца для доклинического моделирования, что способствует снижению рисков при изучении механизмов действия терапевтических кандидатов. Обеспечивая точный контроль над размерами и составом ткани, этот подход повышает прогностическую достоверность процессов валидации мишеней и разработки анализов на ранних этапах. Данный метод снижает зависимость от систем на основе каркасов, повышая трансляционную значимость для скрининга лекарственных препаратов и моделирования заболеваний.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранний поиск и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет проверять терапевтические гипотезы с помощью самособирающихся тканевых колец, которые проясняют функциональность путей и взаимодействие с мишенями.
- Операционная ценность: способствует снижению биологических рисков, предоставляя воспроизводимую систему для оценки модуляции мишеней в контексте трехмерных тканей.
- Прогностическая ценность: оптимизирует отбор проектов в портфеле за счет получения функциональных данных, которые коррелируют с реакциями тканей на исследуемые соединения.
Скрининг и разработка анализа
- Научная ценность: позволяет получать стандартизированные бескаркасные тканевые кольца, подходящие для количественной оценки влияния соединений на механику и функцию тканей.
- Практическая ценность: обеспечивает готовность к анализу за счет воспроизводимого изготовления лунок из агарозы, что снижает вариабельность в последующих кампаниях по скринингу.
- Масштабируемость: способствует повторному использованию платформы для различных типов клеток и моделей тканей, поддерживая эффективные каскады оценки соединений.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между фундаментальными исследованиями и доклинической валидацией путем создания тканевых колец, имитирующих структуру и механические свойства нативной ткани.
- Система, релевантная патологиям: позволяет моделировать ткани сосудов, сердца, скелетных мышц и хрящей с использованием первичных клеток или клеток, полученных из стволовых.
- Снижение рисков при разработке: предоставляет функциональные и гистологические конечные точки для принятия решений о целесообразности дальнейшего проведения исследований (go/no-go) перед началом исследований in vivo.
Интеграция конвейера и рабочего процесса
Данный метод интегрируется в рабочие процессы раннего поиска путем обеспечения возможности создания тканей на основе гипотез, что способствует идентификации ведущих соединений посредством функционального и механического фенотипирования.
- Биология открытий: способствует снижению рисков при изучении механизмов, позволяя исследовательским группам оценивать зависимое от мишени формирование, прочность и функцию тканей в контролируемой 3D-среде.
- Скрининг: обеспечивает получение готовых к анализу тканевых колец с одинаковыми размерами, что позволяет проводить надежный скрининг соединений для выявления фенотипов на уровне тканей.
- Аналитика: предоставляет количественные данные, включая диаметр ткани, сократительную силу и гистологические маркеры для сравнительного анализа условий.
- Трансляционные исследования: обеспечивают непрерывность перехода от этапа открытий к доклиническому применению путем создания моделей тканей, пригодных для механической, функциональной и гистологической оценки.
- Корпоративное повторное использование: представляет рабочий процесс с использованием форм, напечатанных на 3D-принтере, как многократно используемую платформу для создания различных тканевых колец в рамках разных проектов и для разных типов клеток.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Повышает точность прогнозов за счет снижения механистической неопределенности во взаимодействиях между тканью и мишенью.
- Операционная ценность: Улучшает стандартизацию и воспроизводимость благодаря изготовлению форм с низкой вариативностью и возможностью настройки.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность использования капитала, обеспечивая возможность быстрой итерации моделей тканей без появления артефактов, связанных со скаффолдом.
- Влияние на портфель: Поддерживает приоритезацию с учетом рисков за счет получения ранних функциональных данных о тканеинженерных моделях.
Особенности реализации
- Требуется опыт в области CAD-проектирования, 3D-печати и методов стерильного культивирования тканей.
- Необходим доступ к 3D-принтеру, способному производить глянцевые термостойкие пластиковые детали, а также стандартному оборудованию для приготовления PDMS/агарозы.
- Для получения воспроизводимых результатов требуется межкомандная стандартизация параметров конструкции форм, плотности посева клеток и условий культивирования.
- При применении метода к различным типам клеток или тканей требуются корректировки, особенно в отношении концентрации агарозы и диаметра отверстий.
- Существуют практические ограничения, такие как необходимость точного формования агарозы во избежание деформации лунок и важность оптимизации количества клеток на лунку для обеспечения однородного формирования колец.
