При приеме внутрь люминесцентные, магнитные наночастицы для определения способности поглощения жидкости в насекомых

Общей целью данной процедуры является оценка физиологических параметров кормления насекомых, питающихся жидкостью, с помощью раствора сахарозы, смешанного с флуоресцентными магнитными наночастицами. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области энтомологии, такие как структура, функция, взаимоотношения ротовых частей насекомых и механизмы питания насекомых. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет определить, способны ли насекомые поглощать жидкости, которые присутствуют либо в виде бассейнов, либо в виде жидких пленок.

В этой демонстрации используются синие бутылочные мухи, потому что их способность поглощать жидкость и морфология ротовой части хорошо задокументированы. Можно использовать комнатных мух, капустных бабочек и других насекомых, питающихся жидкостью. Получите куколок мух и поместите их в камеру с 18 часами света в сутки и температурой 23 градуса по Цельсию.

взрослые особи выйдут из куколок, не кормите их перед экспериментом. Для экспериментального питания готовят 20-процентный раствор сахарозы с 0,5 миллиграммами наночастиц на миллилитр. Затем подготовьте станцию подачи, состоящую из манипулятора, зажима и подающей ступени.

На этапе кормления придерживайте корм вогнутой горкой. Также подготовьте различные фильтры из капроновой сетки и мембранные фильтры разного размера пор для покрытия вогнутого предметного стекла. Начните с того, что заверните тела, ноги и крылья насекомого в сложенную папиросную бумагу.

Оставьте открытыми только головную и ротовую части. При этом держите насекомое в безопасности, сжав его крылья. Теперь закрепите крылья, завернутые в папиросную бумагу, между двумя предметными стеклами микроскопа.

Затем зажмите два ползуна и закрепите зажим на манипуляторе. Затем закрепите насекомое над этапом кормления с помощью манипулятора. Далее внесите 30 микролитров питательного раствора в середину вогнутого предметного стекла и накройте раствор пористым листом фильтровальной бумаги.

Капелька будет распространяться по фильтровальной бумаге, заполняя поры. Затем расположите насекомое так, чтобы дистальные отделы ротовой части могли соприкасаться с смоченной фильтровальной бумагой так, чтобы можно было добраться только до плоской части предметного стекла, и насекомое не могло питаться из вогнутой области. Теперь с помощью булавки от насекомых удлините ротовые части на фильтровальной бумаге и дайте насекомому поесть в течение 45 секунд.

Если насекомое не проявляет интереса к кормлению, приложите ротовой аппарат к фильтровальной бумаге для заполнения 45 секунд с помощью булавки. На этом протокол кормления завершен. Для вскрытия загрузите 50-миллилитровое стекло для часов с достаточным количеством PBS, чтобы покрыть тело насекомого.

Настройте его вместе со всеми инструментами для препарирования под микроскопом. Теперь снимите насекомое с папиросной бумаги, держа его крылья сомкнутыми. Затем удалите голову, ноги и крылья с помощью пружинных микрорассекающих ножниц и поместите грудную клетку и брюшную полость в PBS.

Чтобы рассечь кишечник, сначала возьмитесь за дистальный отдел кутикулы живота и разрежьте кутикулу в переднем направлении вдоль боковой стороны от заднего конца к грудной клетке. Обратите особое внимание на то, чтобы была срезана только кутикула и чтобы пищеварительный канал не был поврежден. Затем удалите кутикулу живота, жировое тело и другие структуры с помощью булавок от насекомых до тех пор, пока в стекле часов не останется только грудная клетка и пищеварительный канал.

Теперь определите культуру. Это мешочевидная структура, расположенная недалеко от стыка грудной клетки и брюшной полости. При необходимости сделайте дополнительные разрезы в грудной клетке, чтобы выявить урожай.

Затем отрежьте оставшуюся грудную клетку, оставив только пищеварительный канал и урожай. Чтобы проверить наличие проглоченных наночастиц, начните с использования тонкоточечных рассекательных щипцов для переноса культуры на покровный лист для визуализации. Соблюдайте осторожность, чтобы не допустить разрыва урожая.

Немедленно визуализируйте кроп на инвертированном конфокальном микроскопе с 20-кратным увеличением с использованием канала CY3 или фазового контраста. Чтобы идентифицировать проглоченные наночастицы, помашите магнитным стержнем примерно в 10 миллиметрах от урожая. Сделайте так, чтобы каждое движение вперед и назад занимало примерно одну секунду.

Взмахивая магнитом, медленно перемещайте рабочую ступень, чтобы сканировать движение наночастиц внутри почти прозрачной культуры. Если наночастицы присутствуют в урожае, они будут волноваться в унисон с магнитной мешалкой. Насекомое, питающееся раствором с пористой поверхности, должно создать стабильный жидкий мостик через нестабильность плато, чтобы преодолеть капиллярное давление, которое удерживает жидкость в порах.

Предполагается, что размер питательного канала насекомого будет определять наименьший размер пор, из которых они могут питаться. После того, как насекомых препарировали, чтобы оценить, были ли они проглочены, их ротовые части были визуализированы, чтобы измерить размер канала пищевого канала. У мух измеряли диаметр псевдотрахеи и ротового отверстия.

Анализ проглоченных наночастиц свидетельствует о тесной взаимосвязи между размером канала дистальной части рта и наименьшим размером пор, из которых насекомое может питаться. Эта связь не наблюдается с проксимальными частями рта. Следовательно, поглощение жидкости двукрылыми в первую очередь происходит в псевдотрахее, а не в ротовом отверстии, и капиллярное действие должно играть важную роль в питании.

После просмотра этого видео вы должны хорошо понимать, как кормить насекомых раствором наночастиц, препарировать их, чтобы изолировать урожай, а затем осмотреть урожай на наличие наночастиц. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно быть осторожным во время вскрытия. Если урожай будет разорван, он может пролить содержимое жидкости и наночастицы, тем самым испортив ваш образец.