Гибкие измерение биолюминесцентных репортеров с использованием автоматизированной продольной Люцифераза изображений газа и температуры оптимизированных рекордер (крокодил)

Общая цель этой системы состоит в том, чтобы обеспечить легкое наблюдение за биолюминесцентными репортерами в широком диапазоне внеклеточных условий, в том числе при постоянной перфузии среды. Этот метод может быть использован для наблюдения биолюминесценции в продольном направлении от культивируемых клеток и тканей. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет вести запись с клеток в различных внеклеточных средах и газовых условиях, что невозможно в большинстве существующих систем.

Хотя здесь мы демонстрируем эту технику в контексте экспериментов с циркадными ритмами, она может быть легко применена к другим системам, требующим биолюминесценции или флуоресцентной записи в масштабах от нескольких дней до недель. Чтобы начать процедуру, засейте культивируемые клетки на чашках или планшетах для культивирования тканей. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия до тех пор, пока монослои не достигнут 100% слияния.

Непосредственно перед экспериментом используйте управляемый компьютером велосипедный инкубатор, чтобы чередовать температуру от 32 до 37 градусов Цельсия каждые 12 часов в течение как минимум 72 часов, чтобы синхронизировать клеточные ритмы. Надежная синхронизация клеточных циркадных колебаний как внутри культур, так и между культурами имеет решающее значение для экспериментальной воспроизводимости. Мы достигаем этого, применяя ежедневные температурные циклы перед каждой записью, которые синхронизируют клетки, имитируя ритмы температуры тела.

В качестве альтернативы, фармакологическая синхронизация также может быть весьма эффективной. Далее соедините 8,3 грамма порошка DMEM с высоким содержанием глюкозы с 900 миллилитрами сверхчистой воды. Размешивайте раствор в течение 30 минут до полного растворения порошка.

Затем добавьте в раствор 50 миллилитров 100 грамм на литр раствора глюкозы, 20 миллилитров pH 7,6, один молярный раствор MOPS и 10 миллилитров 100-кратного раствора пенициллина стрептомицина. Помешивайте смесь в течение 10 минут. Затем добавьте 4,7 миллилитра 7,5%-ного раствора гидрокарбоната натрия и перемешивайте смесь еще пять минут.

Используйте соляную кислоту или гидроксид натрия для регулировки pH до 7,6 при комнатной температуре. Добавьте в раствор сверхчистую воду, чтобы добиться конечного объема в один литр. Отфильтруйте раствор через стерильный фильтр 0,22 мкм в стерильную колбу.

Храните отфильтрованную среду при температуре четыре градуса Цельсия. Непосредственно перед проведением эксперимента дополните желаемое количество исходной среды 10% сывороткой, двумя миллимолярами GlutaMAX, 2% NS21 и одним миллимоляром люциферина. Полученную рабочую среду пропустить через стерильный фильтр 0,22 мкм.

С помощью пятимолярного раствора хлорида натрия отрегулируйте осмоляльность рабочей среды до 350 миллиосмолей. Затем прогрейте средний до 37 градусов Цельсия на водяной бане. Далее, чтобы начать фокусировку камеры биолюминесцентного инкубатора, открутите водонепроницаемый фильтр нейтральной плотности с подогревом.

В программном обеспечении прибора установите время воздействия на 0,2 секунды, а время кинетического цикла на 0,3 секунды. Убедитесь, что умножение электронов отключено, затем закройте окно настройки и начните запись видео. Используйте фокусировочный цилиндр для вращения объектива фотокамеры до тех пор, пока тестовые элементы на соответствующей полке с образцами не окажутся четко сфокусированными.

Затем остановите запись видео. Установите на место фильтр нейтральной плотности и удалите тестовые элементы. Затем с помощью панели управления на передней панели биолюминесцентного инкубатора установите желаемый уровень кислорода, углекислого газа и температуры для эксперимента.

Для эксперимента с увлажненным воздухом заполните поддон для воды в основании инкубатора. Извлеките клетки из инкубатора для тканевых культур и замените питательную среду предварительно подогретой рабочей средой. Для увлажненных экспериментов с использованием небольших объемов заклейте пластины газопроницаемой пленкой или скотчем.

Поместите пластины в биолюминесцентный инкубатор. Закройте инкубатор и закрепите крышку дверцы, чтобы исключить попадание света в систему. Затем в программном обеспечении прибора установите режим сбора данных в кинетический.

Установите желаемое время экспозиции. Установите накопления равным единице, длину кинетического ряда — желаемому числу циклов сбора данных, а время кинетического цикла — нужному интервалу визуализации. Установите скорость переключения 4,33 микросекунды, усиление единицу и усиление ЭМ нужного уровня.

Затем установите тип файла автосохранения на sif или tiff. Присвойте файлу автосохранения имя и укажите путь к нему. Установите тип файла спулинга на sif или tiff.

Назовите стек файлов и укажите путь к нему. Закройте окно настройки и начните запись данных. После завершения сбора данных импортируйте полученный стек изображений в программное обеспечение для обработки изображений.

Отрегулируйте яркость и контрастность для оптимального просмотра биолюминесценции. Затем выберите области интереса и экспортируйте сигнал среднего значения для выбранных областей. Скопируйте данные в аналитическое программное обеспечение для дальнейшей обработки.

Для начала эксперимента затравили ячейки на одноканальные предметные стекла с разъемами Люэра и глубиной канала 0,6 или 0,8 миллиметра. Культивируйте и увлекайте клетки. Приготовьте и подогрейте гидрокарбонатную буферную среду для перфузии DMEM с низким содержанием глюкозы.

Далее отрежьте пять двухсантиметровых отрезков силиконовой трубки с внутренним диаметром один миллиметр. Отрежьте 1,2-метровую, 10-сантиметровую и 30-сантиметровую трубку внутреннего диаметра толщиной 1 миллиметр из этилентетрафторэтилена. Простерилизуйте трубку 70% этанолом и промойте трубку стерильным PBS.

Используйте стерилизованную силиконовую трубку для подключения 1,2-метровой трубки ETFE к стерильному внутреннему соединителю Люэра и стерильному локтевому соединителю Люэра. Используйте эту сборку для подсоединения шприца перфузионной среды к пустому предметному стеклу канала Люэра. Далее замените среду для культивирования клеток на предварительно подогретую перфузионную среду.

Наполните 20-миллилитровый стерильный шприц предварительно подогретой перфузионной средой. Установите 10-сантиметровую трубку из ETFE с разъемами Люэра с помощью силиконовой трубки и подсоедините трубку к предметному стеклу. Промойте от трех до пяти миллилитров перфузионной среды через трубку и предметное стекло канала.

Затем установите 30-сантиметровую трубку ETFE на предметное стекло, содержащее ячейки. Подсоедините свободный конец 10-сантиметровой трубки из ЭТФЭ к другому концу предметного стекла клеточного канала, чтобы сформировать полную систему перфузии. Промывайте один миллилитр перфузионной среды через трубки и предметные стекла, чтобы исключить пузырьки воздуха.

Транспортируйте систему перфузии в биолюминесцентный инкубатор. Закрепите шприц, наполненный перфузионной средой, в шприцевом насосе, стараясь не отсоединить трубку. С помощью шприцевого насоса промывайте один миллилитр перфузионной среды через систему перфузии.

Введите диаметр шприца на насосе и установите расход на 50 микролитров в час. Важно, чтобы в начале эксперимента в перфузионной системе не было пузырьков, так как они могут нарушить сигнал биолюминесценции. Запустите насос и сразу же закройте дверцу биолюминесцентного инкубатора.

Застегните крышку двери, чтобы исключить попадание света в систему. Соберите и проанализируйте данные, как описано для статических культур тканей. Шесть планшетов фибробластов PER2 LUC были захвачены с помощью суточных температурных циклов и визуализированы с помощью биолюминесцентного инкубатора.

Были проанализированы изображения из выбранных скважин и количественно определен выход биолюминесценции. Клетки PER2 LUC также были визуализированы в условиях перфузии для оценки влияния ингибитора казеинкиназы на экспрессию PER2 LUC. Результаты сравнивали с клетками, обработанными той же концентрацией ингибитора в статических условиях, которые показали значительно большее удлинение периода в статических условиях.

Было обнаружено, что величина удлинения периода в условиях перфузии близка к наблюдаемой in vivo. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить как статические, так и перфузионные биолюминесцентные эксперименты с использованием АЛЛИГАТОРА.