Всеобъемлющий рабочий процесс для идентификации генома и выражение мета анализа семьи ATL E3 убиквитин лигаза гена в Грейпвайне
22 декабря 2017 г.
Эта статья описывает процедуру идентификации и характеристика гена семьи в виноградной лозы, применяется к семье ligases убиквитин E3 Arabidopsis Tóxicos в Levadura (библиотека ATL).
Общая цель этой процедуры заключается в достижении исчерпывающей характеристики семейства генов у растений в соответствии с глобальным подходом, включая определение структуры генов, соответствующих белковых мотивов, расположения хромосом, дупликации генов и паттернов экспрессии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в классификации растений по семействам, такие как мировая геномная идентификация членов семейства и их транскриптомия обеспечивается за счет анализа экспрессии генов. Основным преимуществом всей процедуры является предоставление исчерпывающего перечня экспериментальных этапов для достижения полной характеристики семейства генов.
Эта процедура может быть применена к любому семейству генов любых видов растений, для которых имеются генетические данные. Более того, такой подход дает ценную информацию для выявления интересных кандидатов для функциональных исследований. Демонстрировать всю процедуру будет Пьетро Ариани из моей лаборатории.
Откройте веб-страницу Blast и нажмите на раздел о протеиновом бласте. В поле ввода последовательности запроса введите аминокислотную последовательность белка, который будет использоваться в качестве зонда для идентификации других членов семейства. Используйте белок, который обладает всеми важными особенностями, характеризующими семейство.
Далее в поле выберите поисковый набор, выберите базу данных эталонных белков и интересующий организм. Теперь в поле выбора программы выберите алгоритм PSI-BLAST. При желании нажмите на параметры алгоритма, чтобы настроить расширенные параметры, такие как максимальная целевая последовательность и матрица подсчета очков.
Значение E — это пороговое значение, которое для данного поиска уменьшается с 005 до 001. Нажмите кнопку BLAST, чтобы запустить анализ. Из всех последовательностей, отображающих относительные совпадения с запросом, отмените выбор записей, которые явно не принадлежат к семейству.
Для этого нажмите на галочку в столбце выбора для PSI-BLAST. Затем запустите вторую итерацию PSI-BLAST, нажав кнопку «Начать». Все вновь выявленные последовательности будут выделены желтым цветом.
Опять же, отмените выбор хитов, которые не принадлежат к семейству. Продолжайте этот процесс до тех пор, пока алгоритм не найдет ни одной релевантной записи или не достигнет сходимости. После того, как все ложноположительные результаты будут отсеяны, соберите аминокислотные последовательности в файл, отформатированный в формате FASTA, и загрузите файл в пакет программного обеспечения для биоинформатики.
Затем выберите все импортированные последовательности в списке и нажмите кнопку «Выровнять/собрать» на панели инструментов. Затем нажмите Парное множественное выравнивание и выберите ВЫРАВНИВАНИЕ МЫШЦ и OK. Теперь выравнивание будет производиться с использованием значений по умолчанию. Теперь визуализируйте последовательность логотипа выравнивания и осмотрите гены визуально для поиска ложноположительных результатов.
Дальнейший анализ физических параметров и доменов белка, распределения хромосом, дупликации и организации интронов экзонов описан в текстовом протоколе. Затем проанализируйте отношения между членами семейства ATL путем построения высококачественного филогенетического дерева и определения номенклатуры семейства. Во-первых, извлеките из базы данных UmoProt последовательности ATL, необходимые в качестве ссылок для номенклатуры генов виноградной лозы.
Затем создайте файл FASTA, включающий все нуклеотидные последовательности виноградной лозы и членов семейства генов Arabidopsis для филогенетического анализа. Теперь просмотрите домашнюю страницу филогенеза Франция и выберите конвейер анализа филогенеза. В большинстве случаев подходит один клик, но при необходимости можно выбрать конкретные расширенные настройки с помощью расширенных опций или даже полностью настроить анализ с помощью опций a la carte.
Затем введите имя для анализа и загрузите файл FASTA. Затем нажмите кнопку «Отправить», чтобы запустить анализ. Если эта процедура приводит к появлению сообщения об ошибке, завершите каждый шаг конвейера набора филогенеза по отдельности.
Сначала перейдите на домашнюю страницу программного обеспечения MUSCLE и загрузите файл FASTA. Выберите Pearson FASTA в качестве выходного формата и отправьте документ. Далее скачайте файл в формате FASTA и исключите все плохо выровненные позиции.
Откройте инструмент сервера G-block, загрузите файл FASTA для выравнивания, выберите ДНК в качестве типа последовательности и выберите строгость, которая лучше всего подходит для анализа. Для выравнивания семейства генов ATL виноградной лозы выберите все три предложенных варианта для менее строгого отбора из-за высокой дивергенции последовательностей. Затем нажмите «Получить блоки», чтобы запустить анализ.
Чтобы сохранить результаты, нажмите на полученное выравнивание в нижней части страницы вывода и создайте новый файл FASTA. G-блоки устраняют плохо выровненное положение в расходящихся участках ДНК или подталкивающее выравнивание, чтобы он стал более подходящим для филогенетического анализа. На этом этапе выбор параметров impericle для строгости столбцов имеет решающее значение, чтобы убедиться, что они являются обузой для трех столбцов.
Чтобы завершить древо, мы обратимся к домашней странице Phylogeny France. Там выберите конвейер по выбору и снимите следующие опции: множественное выравнивание и курирование выравнивания. Затем нажмите кнопку «Создать расчетную схему», загрузите курируемый файл FASTA G-блоков, выберите процедуру начальной загрузки и используйте параметры и настройки по умолчанию.
Наконец, нажмите кнопку «Отправить», чтобы запустить анализ. На этом пошаговый процесс завершен. Теперь, когда филогенное дерево создано, свернем плохо поддерживаемые ветви со значениями начальной загрузки менее 70%, а затем загрузите окончательные результаты в формате Newick для дальнейшего анализа.
Текстовый протокол содержит инструкции по присвоению имени гена на основе филогенеза. Для этого протокола создайте отжатый, линейный, текстовый файл с нормализованными значениями экспрессии arma, взятыми из библиотеки экспрессии генов. Организуйте значения для каждого гена семейства в одних и тех же строках шаблона.
Затем выполните иерархический бикластерный анализ с помощью программного обеспечения для просмотра нескольких экспериментов. Для начала загрузите рабочую матрицу данных и выберите текстовый файл. Выберите одноцветный массив и снимите галочку с аннотации загрузки, если автоматическая аннотация не предусмотрена.
Выберите крайнее левое верхнее значение выражения в окне предварительного просмотра таблицы выражений и нажмите кнопку загрузки. Далее корректируем данные, применяя преобразование Log2 и нормализацию генов/строк. Затем установите правильный предел масштаба.
Теперь рассчитаем иерархическую кластеризацию. В поле Оптимизация упорядочивания выберите Оптимизировать порядок листьев гена и Оптимизировать порядок листьев образца. Затем в поле выбора метода связи выберите кластеризацию средней связи, а в поле выбора матрицы расстояний выберите корреляцию Пирсона.
Затем нажмите OK, чтобы запустить анализ. Просмотрите результаты на левой панели окна и экспортируйте тепловую карту, нажав кнопку «Сохранить изображение» в меню файла. Наиболее похожий ген на arabidopsis thaliana ATL2, согласно поиску BLAST-P, был использован для обследования членов семейства ATL в геноме виноградной лозы.
Анализ PSI BLAST сошелся после нескольких циклов, предоставив список предполагаемых генов в семействе генов. Наличие канонического кольцевого домена H2 для каждого кандидата оценивалось путем визуального осмотра выравнивания MUSLAM. Это сузило поиск до 96 генов виноградной лозы.
Для составления номенклатуры был использован филогенетический анализ идентифицированных генов с сравнением их с семейством генов ATL arabidopsis. 13 из 96 ATL виноградной лозы получили специфический идентификатор в виде ортолога гена ATL arabidopsis. Сопоставление идентифицированных генов с глобальным атласом экспрессии генов виноградной лозы с использованием иерархического бикластерного анализа показало, что все 96 экспрессируются по крайней мере в одной ткани и могут быть идентифицированы пять кластеров экспрессии.
Аналогичный подход был применен для изучения экспрессии этих генов в ответ на биотические стрессы. Наблюдалось непосредственное участие семейства генов ATL в ответе на патогенную инфекцию с 62 генами, демонстрирующими значительную модуляцию по крайней мере в двух условиях. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как работать с программным обеспечением, используемым для характеристики семейства генов.
При попытке выполнить эту процедуру важно тщательно определить характеристики данного семейства генов и соответствующий зонд, используемый для идентификации всего члена семейства генома. Следуя этой процедуре, можно исследовать эволюцию семейств генов и функцию Р30 путем создания дополнительных филогенетических деревьев на основе некоторых видов, отличных от видов, необходимых для атрибуции номенклатуры семейств генов.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
Эта статья описывает процедуру для идентификации и характеристики семейства генов в винограде, конкретно сосредотачиваясь на E3 убикуитин-лигазах Arabidopsis Tóxicos in Levadura (ATL). Метод нацелен на обеспечение всестороннего понимания структуры гена, белковых мотивов, хромосомного расположения, дупликации генов и паттернов экспрессии.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Генетика растений
- Характеристика генов
- Убикуитин-лигазы
Предыстория
- Понимание семейств генов важно для классификации растений.
- Анализ экспрессии генов помогает в идентификации членов семейства.
- Характеристика может выявить функциональные кандидаты для дальнейших исследований.
- Этот метод применим к любому виду растений с доступными генетическими данными.
Цель исследования
- Достичь исчерпывающей характеристики семейства генов.
- Определить структуру гена и связанные белковые мотивы.
- Анализировать дупликации генов и паттерны экспрессии.
Используемые методы
- Глобальная геномная идентификация членов семейства генов.
- Транскриптомный анализ для профилирования экспрессии генов.
- Экспериментальные шаги для полной характеристики семейства генов.
- Применение процедуры к различным видам растений.
Основные результаты
- Предоставлен исчерпывающий список экспериментальных шагов.
- Идентификация интересных кандидатов для функциональных исследований.
- Обзор классификации семейств генов в растениях.
- Демонстрация процедуры Пьетро Ариани.
Выводы
- Процедура предлагает системный подход к характеристике семейств генов.
- Она улучшает понимание генетики и эволюции растений.
- Ценна для будущих исследований в области биологии растений.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Genome-wide identification and meta-analysis of gene families, such as ATL E3 ubiquitin ligases in grapevine, enable systematic target validation and mechanistic de-risking in plant biotechnology pipelines. This workflow supports predictive confidence in functional genomics, informing candidate prioritization for trait engineering and stress adaptation studies. The approach is broadly applicable to any plant species with genomic data, enhancing portfolio decision-making in agricultural R&D.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables comprehensive cataloging of gene family members for hypothesis-driven target selection.
- Supports mechanistic de-risking by clarifying gene structure, duplication, and conserved motifs.
- Facilitates functional annotation and prioritization of candidates for downstream validation.
Screening & Assay Development
- Provides standardized gene family datasets for assay development and screening workflows.
- Enables reproducible identification of expression patterns across tissues and conditions.
- Supports scalable analysis of gene function and response to biotic stressors.
Translational & Preclinical Research
- Aligns gene expression clusters with phenotypic outcomes relevant to stress adaptation.
- Enables continuity from discovery genomics to trait validation in preclinical plant models.
- Supports risk-adjusted advancement of gene candidates for functional studies.
Pipeline & Workflow Integration
This workflow integrates from early discovery through lead identification and preclinical trait validation in plant biotechnology pipelines.
- Discovery Biology: Supports genome-wide hypothesis testing and gene family classification for target validation.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative gene expression profiles for candidate triage.
- Analytics: Provides hierarchical clustering and phylogenetic outputs to compare gene family members.
- Translational Research: Links gene expression modulation to stress response phenotypes in plants.
- Enterprise Reuse: Offers a reusable informatics workflow adaptable to any plant gene family with available genomic data.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in gene function and target selection.
- Operational Value: Standardizes gene family characterization and expression analysis across projects.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for candidate advancement and resource allocation.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of gene targets for trait engineering and stress adaptation.
Implementation Considerations
- Requires expertise in bioinformatics, phylogenetics, and gene expression analysis.
- Depends on access to genomic databases, alignment tools, and clustering software.
- Necessitates standardized data processing and annotation protocols across teams.
- Adaptable to diverse plant species and gene families with available sequence data.
- Stringency in alignment and clustering parameters is critical for reliable outputs.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:04
Identifying Putative Gene Family Members, Making Alignments, and Sequence Logos
3:33
Phylogenetic Analysis and Nomenclature
6:51
Tissue Expression Meta-analysis
8:27
Results: Identified ATL Gene Family Members in the Grapevine Genome
9:52
Conclusion
