Изоляция и дыхательных измерения митохондрий от Резуховидка Таля

Общая цель выделения интактных и чистых растительных митохондрий заключается в изучении дыхания, митохондриального состава, биогенеза и метаболизма. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы биологии растительной энергии, такие как важность митохондрий и стрессоустойчивость в изменяющихся условиях окружающей среды. Основное преимущество этого метода заключается в том, что из относительно небольших количеств растительной ткани можно выделить достаточное количество чистых, неповрежденных и функциональных митохондрий.

Демонстрировать процедуру будут Вэньхуэй Лю и Дженнифер Селински из моей лаборатории. В день выделения митохондрий промойте градиентный заливщик и перистальтические трубки из ПВХ деионизированной водой для подготовки градиентов. Наклоните, чтобы расположить две центрифужные пробирки объемом 50 мл на льду таким образом, чтобы выходное отверстие перистальтической трубки касалось стенки пробирок.

Затем поверните черный рычаг вниз, чтобы закрыть соединение между внутренней и внешней камерами. Поместите градиентный заливщик с магнитной мешалкой внутрь внутренней камеры на магнитную мешалку. Затем налейте во внутреннюю камеру 35 мл тяжелого градиентного раствора.

Дозируйте половину тяжелого градиентного раствора через перистальтический насос со скоростью 300 мл в час в две центрифужные пробирки, находящиеся на льду. Затем в наружную камеру налейте 35 мл светового градиентного раствора. Немедленно поверните черный рычаг вверх наполовину, чтобы возобновить соединение между внутренней и внешней камерами, чтобы растворы мягко перемешались.

Вытолкните всю градиентную смесь из камер со скоростью 60 мл в час, чтобы сформировать два непрерывных градиента от 0% до 4,4% PVP. Перед использованием всегда держите градиенты на льду. Важно не перегружать растительную ткань, иначе митохондрии разрушатся.

Для одного приготовления разрежьте всю ткань розетки не менее чем с 80 четырехнедельных растений арабидопсиса, выращенных на почве. Затем добавьте половину срезанных растительных тканей в остывшую крупную ступку и пестик, содержащий 75 мл шлифовальной среды. Затем с помощью шлифовальной среды увлажните четыре слоя фильтрующего материала, с размером пор от 20 до 25 м.

Используйте пластиковую воронку, чтобы отфильтровать гомогению через все четыре слоя фильтрующего материала, и соберите его в коническую колбу объемом 500 мл. Используйте еще 75 мл шлифовальной среды, чтобы измельчить вторую половину ткани. Затем смешайте весь гомогенат в фильтрующем материале, чтобы отфильтровать как можно больше.

Используйте 150 мл мелющей среды, чтобы измельчить всю оставшуюся ткань на фильтрующем материале, и отфильтруйте в коническую колбу объемом 500 мл. Распределите отфильтрованный гомогенат по восьми предварительно охлажденным пластиковым пробиркам центрифуги объемом 50 мл. И центрифугируйте при 2 500 g при четырех градусах Цельсия, в роторе с фиксированным углом, в течение пяти минут.

После заливки надосадочной жидкости в чистые центрифужные пробирки снова центрифугируйте при 17 500 g, при четырех градусах Цельсия, в течение 20 минут, в роторе с фиксированным углом. Оставьте в пробирке 3 мл надосадочной жидкости. Затем с помощью тонкой кисти аккуратно повторно суспендируйте гранулу в оставшейся надосадочной жидкости.

Добавьте 10 мл промывочного буфера одной концентрации в каждую из пробирок и объедините все четыре пробирки в одну центрифужную пробирку, в результате чего получится две пробирки. Отрегулируйте объем до 50 мл с помощью буфера для промывки одинарной силы и повторите этапы центрифугирования. Используя очень небольшое количество буфера для промывки, диспергируйте гранулу тонкой кистью, а затем используйте пипетку, чтобы собрать сырую митохондриальную гранулу в пробирку.

Затем аккуратно нанесите слой митохондриальной суспензии с помощью пипетки, на два непрерывных градиента от 0% до 4% PVP. Используйте буфер для промывки одинарной силы, чтобы сбалансировать вес пробирок, и проведите центрифугирование при 40 000 г при четырех градусах Цельсия в течение 40 минут. Не забудьте выключить тормоз.

Осторожно отсасывайте верхние пять сантиметров раствора над митохондриальной полосой. Затем распределите митохондриальный раствор по двум чистым пробиркам и заполните буфером для промывки одинарной силы. Накройте горлышко трубки пластиковой парафиновой пленкой, и переверните ее несколько раз, чтобы равномерно распределить коллоидный градиент плотности и митохондрии.

Затем центрифугируйте при 31 000 g в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия, с медленным торможением. Отберите надосадочную жидкость и отрегулируйте объем пробирки до 50 мл с помощью буфера для промывки одинарной силы. Переверните несколько раз для правильного перемешивания.

Центрифугируйте раствор при 31 000 г в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия с медленным торможением. Отсадите надосадочную жидкость, а затем соберите митохондриальную гранулу в 500 л промывочного буфера однократной силы, используя пипетку с модифицированным наконечником на 200 л. При открытом поршне добавьте в реакционную камеру 970 л насыщенной воздухом дыхательной среды.

Затем добавьте 150 г общего митохондриального белка с помощью модифицированной пипетки и 500 М аденозинтрифосфата в реакционную камеру, чтобы определить митохондриальное дыхание. Используйте магнитную мешалку для непрерывного перемешивания митохондриальной суспензии. Закрыв поршень, нажмите «Начать запись», чтобы зафиксировать потребление кислорода.

Подождите минуту или две, чтобы проверить линейную кривую потребления кислорода, указывающую на стабильное потребление кислорода. Затем добавьте 5 мМ сукцината и записывайте потребление кислорода в течение примерно двух минут. Добавьте 1 мМ аденозиндифосфата и продолжайте записывать норму потребления кислорода еще две минуты.

Затем добавьте 1 мМ никотинамидадениндинуклеотида водорода и продолжайте записывать потребление кислорода в течение примерно четырех-восьми минут. Затем добавьте реагенты для ингибирования пути цитохрома С и продолжайте записывать потребление кислорода с помощью альтернативной оксидазы в течение примерно двух минут. KCN, миксотиазол и антимицин А являются респираторными ядами.

Важно следовать инструкциям по технике безопасности, приведенным в паспортах MSDS. Обратите внимание, что в разных странах будет разное законодательство по использованию этих ингибиторов в наших экспериментах. Далее добавьте 5 мМ дитиотреитол, и 10 мМ пируват для активации альтернативной оксидазы.

И продолжайте записывать еще пять-семь минут. Наконец, добавьте 500 мМ N-пропилгаллата и записывайте в течение двух минут. Репрезентативный градиент, показывающий наличие зеленовато-белой митохондриальной фракции в нижней части градиентного раствора.

Тилакоиды и другие загрязнители, присутствующие поверх градиентного раствора, обозначены темно-зелеными полосами. Репрезентативные следы потребления кислорода митохондриями, чтобы показать целостность внешней мембраны до измерения потребления кислорода. Целостность внешней мембраны была хорошо сохранена и почти на 90% неповреждена.

Репрезентативные следы потребления кислорода митохондриями после добавления субстратов, ингибиторов и эффекторов. Результаты показывают скомпрометированный цитохром с и альтернативный оксидазный путь. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как выделять и анализировать митохондрии растений.