Применение измерений электрофизиологии для изучения деятельности перевозчиков электро нейтральный

Метод гигантских участков в сочетании с ионоселективными микроэлектродами является универсальным методом, используемым для обнаружения и количественного определения потоков ионов. В частности, он используется для измерения потоков протонов, генерируемых активностью электронейтрального транспортера ионов, натрий-водородного теплообменника или NHE, которая выражается на клеточной мембране. Натрий-водородный обменник генерирует градиент протонов в непосредственной близости от плазматической мембраны, обозначенной здесь оранжевым кольцом.

Этот градиент протонов на клеточной мембране измеряется с помощью записи клеточного зажима в сочетании с методом, в котором используется протонный селективный микроэлектрод. Протонселективный микроэлектрод перемещается близко к поверхности клетки, где он регистрирует поток протонов, выходящих из клеток, показанных здесь в положении А. И от поверхности клетки, где он регистрирует концентрацию свободных протонов, присутствующих в растворе, указанном в положении В. А затем, возвращаясь в положение А, близко к клеточной мембране, в повторяющемся, колебательном движении. Разница напряжений между точками А и В регистрируется и зависит от представителя активности НВЭ.

Ионы-транспортеры, такие как протоны, через клеточную мембрану влияют на процессы, необходимые для жизни. Таким образом, изменения pH жестко регулируются множеством молекул, включая натрий-протонный обменник, систему исключения протонов плазматической мембраны. Осциллирующий pH-микроэлектрод в сочетании с зажимом целой ячейки представляет собой новый подход к изучению потока протонов, опосредованного активностью натрий-протонного обменника.

Применение этих методов позволяет преодолеть некоторые из основных ограничений обычно используемых методов измерения активности натрий-протонного обменника, такие как умеренная чувствительность и временное разрешение, а также другой хороший контроль внутриклеточной среды. Я продемонстрирую методы вместе с моим сотрудником, доктором Виктором Бабичем. Доктор Мэтью Генри будет рассказчиком.

Мы продемонстрируем применение этого метода, измерив активность изоформы три-натрий-протонита, которая является основным регулятором абсорбции соли в воде через кишечник и почечный эпитилий. Протонные селективные микроэлектроды для измерения концентрации протонов изготавливаются из стандартных трубок из боросиликатного стекла. Электроды из боросиликатного стекла с внешним диаметром 1,2 миллиметра и без нити накала вытягиваются вертикальным съемником, используя обычный протокол двойного вытягивания.

Получается наконечник для пипетки диаметром от двух до трех микрометров. Пипетки помещаются в держатель для банок кончиком пипетки вверх. Далее готовится смесь для силиконизации пипеток.

Его пересыпают в банку и плотно закрывают крышкой. Пипетки инкубируют с силиконизационной смесью в течение 24–48 часов. Соблюдайте осторожность, обязательно готовьте смесь и силиконизируйте пипетки при комнатной температуре в хорошо проветриваемом химическом вытяжном шкафу.

Снова наполните пипетку подходящей ионселективной смолой и осторожно поместите ее вертикально в держатель банки кончиком пипетки вниз. Чтобы подготовиться к зажиму патча, начните с вытягивания пипеток для зажима патчей из тонкостенного боросиликатного стекла с внешним диаметром два миллиметра и внутренним диаметром 1,4 миллиметра в вертикальном пуллере с использованием обычного протокола двойного вытягивания. С помощью микрокузницы, установленной на предметном столике инвертированного микроскопа, можно сделать широкий наконечник пипетки.

Расположите пипетку близко к толстой платиновой проволоке микрокузницы. Включите отопление с помощью ножного переключателя, который управляет включением и выключением тока. Нагрейте стекло с низкой температурой плавления, которое покрывает середину толстой платиновой проволоки микрокузницы, а затем переместите наконечник пипетки ближе к расплавленному мягкому стеклу.

При нагревании платиновая проволока немного смещается к центру. Платиновая проволока возвращается в исходное положение, а наконечник пипетки ломается. Повторяйте процедуру до тех пор, пока не будет получен желаемый диаметр кончика, и, наконец, приложите тепло, чтобы разгладить кончик.

Наконечники для пипеток имеют диаметр 10 микрометров после полировки с помощью микрокузницы. Использование толстой платиновой проволоки имеет преимущество в том, что после включения электричества происходит небольшое расширение и меньше вероятность перегрева провода и пипетки из-за чрезмерного тока. После того, как клетки диссоциированы с помощью трипсина и трипсинизация блокируется, клетки поддерживаются на шейкере с покачиванием, чтобы предотвратить образование комков.

Это делается в течение двух часов после трипсинизации. Электрофизиологическая установка состоит из регулятора температуры для регулирования температуры раствора в системе перфузии. Все эксперименты проводятся при температуре около 37 градусов по Цельсию.

И оптический переключатель фильтров для управления колесом фильтров для флуоресцентной визуализации. Контроллер клапанов перфузионной системы для регулирования открытия и закрытия клапанов перфузионной системы. А регулятор температуры для регулирования температуры камеры записи.

Осциллограф для наблюдения за осциллограммами и усилитель с патч-клещом. Компьютер, на котором работает это программное обеспечение Capmeter. И электрометр для регистрации ионселективного сигнала микроэлектродов.

И дифференциальный усилитель для усиления сигнала электрометра. Электрофизиологическая установка оснащена также инвертированным микроскопом с регулятором предметного столика, двумя микроманипуляторами с контроллерами, расположенными слева и справа от микроскопа, перфузионной системой со встроенным нагревателем раствора. После того, как ионселективная микроэлектродная пипетка установлена на микроманипулятор, обратно заполните прижимную пипетку пластыря внутриклеточным раствором.

Следите за тем, чтобы раствор достиг кончика пипетки. Может потребоваться несколько легких нажатий, чтобы удалить пузырьки на кончике пипетки. Затем установите зажимную пипетку пластыря на головной столик электрофизиологической установки.

Аккуратно перенесите здоровые клетки в записывающую камеру, наполненную раствором для ванны определенного объема. Важно, чтобы головная сцена находилась под углом 45 градусов к горизонтальной оси. Это обеспечивает угол входа в пипетку, подходящий для формирования высокопрочного уплотнения.

Пока пипетка с патч-зажимом опускается в раствор для ванны, надавите на пипетку с небольшим положительным давлением, чтобы снизить вероятность блокировки наконечника. Выберите ячейку и подойдите к ней с небольшим количеством положительного давления. Прекратите движение пипетки с патч-зажимом, как только наконечник приблизится к ячейке.

Опустите ионселективный микроэлектрод в раствор ванны до тех пор, пока он не окажется в той же фокальной плоскости, что и наконечник пипетки с патч-зажимом. Когда пипетка расположена по центру над ячейкой, инициируйте запечатывание, приложив небольшое отрицательное давление. Мегаомное уплотнение получается в течение нескольких секунд.

Убедитесь, что удерживающий потенциал поддерживается усилителем на нулевом уровне милливольт. Наконец, разорвите клеточную мембрану серией коротких импульсов всасывания и начните запись. Используя метод записи гигантских пластырей, можно быстро перфузировать растворы в стеклянной пипетке с помощью интрапипетной перфузионной системы для изменения внутриклеточного содержания ионов, липидов и белков.

Расположите ионселективный микроэлектродный пипетку рядом с клеткой, удерживаемой патч-зажимной пипеткой, и начните колебание ионселективного микроэлектродного пипетки, перемещая его к ячейке и от нее. Применение этой методики позволяет изучить молекулярную регуляцию натрий-водородного обменника. Используя метод гигантских пластырей, внутриклеточный состав АТФ и липидов был модифицирован с помощью интрапипетной перфузионной системы.

Внутриклеточная перфузия апиразы, которая гидролизует внутриклеточную АТФ и снижает содержание фосфоинозитида, привела к снижению активности изоформы 3 NHE на 50%. Влияние апиразы на активность NHE3 не было обращено вспять при внутриклеточной перфузии фосфоинозитида, PIP2. Однако это было обращено вспять за счет внутриклеточной перфузии фофоинозитида, PIP3.

Для измерения активности NHE используется комбинация методов протонного селективного микроэлектрода и зажима пластыря. Это позволяет изучить молекулярную основу дифференциальной регуляции NHE фосфоинозитидами и нисходящими сигнальными каскадами. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерить активность натрий-протонного обменника с помощью осциллирующего pH-микроэлектрода в сочетании с зажимом всех клеточных патчей.

И пример возможного применения метода.