Расследование пагубные последствия низкого давления плазмы стерилизации на выживание Bacillus subtilis споры с помощью Live клеток микроскопии

Этот протокол иллюстрирует важный подряд шаги, необходимые для оценки релевантности мониторинга жизнеспособность параметров и процессов репарации ДНК в оживлении спор Bacillus subtilis после лечения с плазмой низкого давления путем отслеживания помечены флуоресцентным ДНК ремонт белков через время решена confocal микроскопии и растровая электронная микроскопия.

Общая цель этого набора последовательных методов заключается в визуализации и мониторинге параметров жизнеспособности в репарации ДНК в оживленных спорах Bacillus subtilis после плазменной обработки низким давлением с использованием конфокальной флуоресцентной микроскопии с временным разрешением и сканирующей электронной микроскопии. Наш метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области микробной инактивации и стерилизации. Это помогает нам проанализировать вредное влияние обработки плазмой низкого давления на биологические показатели, такие как споры Bacillus subtilis.

Основное преимущество нашей методики заключается в том, что мы сочетаем несколько методов определения вида, сканирующую электронную микроскопию и мониторинг репарации ДНК с помощью флуоресцентной микроскопии с временным результатом, чтобы проверить вредное влияние обработки плазмой под низким давлением. Для получения спор необходимо перевести 5 миллилитров культуры соответствующего штамма B.subtilis с добавлением соответствующих антибиотиков в 200 миллилитров жидкой среды для спороношения шейфера двойной концентрации и культивировать ее с помощью энергичной аэрации при температуре 37 градусов Цельсия в течение не менее 72 часов или дольше до тех пор, пока не будет спуляции более 95% культуры. Соберите споры в 15-миллилитровые пробирки путем центрифугирования при 3000 G в течение 15 минут и очистите образцы с использованием стерильной дистиллированной H2O в повторных этапах промывки.

Проверьте чистоту и состояние прорастания с помощью мискроскопии с контрастом лица и убедитесь, что споровые суспензии состоят более чем на 99% из фазовых ярких спор и не содержат вегетативных клеток, пророщенных спор и клеточных остатков, в противном случае дальнейшие эксперименты с микроскопией могут быть нарушены. Определите титр спор путем нанесения 50 микролитров десятикратных серийных разведений на LB-агар для расчета КОЕ и инкубируйте планшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. После определения КОЕ отрегулируйте пробу до 10-9-й споры на миллилитр, концентрируя или используя стерильную воду для разбавления образцов.

Поместите держатель образца в виде стерилизованных микроскопических предметных стекол или круглых 25-миллиметровых защитных колпачков внутрь аэрозольного распылителя с электрическим приводом в соответствии с форсункой. Перенесите культуру спор на впускное отверстие для жидкости форсунки и начните распыление через 0,15 секунды под давлением 1,3 бар. Распыленная споровая суспензия образует тонкую пленку на микроскопическом предметном стекле, которая быстро высыхает в течение нескольких секунд, образуя равномерно распределенный монослой спор

Обработанные носители образцов хранить в стерильном контейнере при комнатной температуре. Чтобы очистить и прогреть все поверхности в плазменной системе, запустите систему на пяти Паскалях с аргоновой плазмой мощностью 500 Вт в течение пяти минут. Предварительная обработка снижает прилипание молекул из окружающего воздуха, таких как азот, кислород и вода, во время вентиляции камеры.

После вентиляции камеры осторожно поместите образцы на стеклянные стеллажи в центре корпуса реактора. Закройте камеру и эвакуируйте ее. После этого используйте нужный технологический газ для заполнения камеры и отрегулируйте давление в системе до пяти Паскалей.

Затем запустите процесс плазменной обработки. По истечении определенного времени обработки отключите электропитание и подачу газа и осторожно проветрите систему, чтобы предотвратить выдувание образцов из держателя образцов. После проветривания извлеките образцы и храните их в стерильном контейнере.

Для контрольных образцов, не обработанных плазмой, подвергайте образцы воздействию вакуума только в присутствии технологического газа, эквивалентного наибольшему времени применения плазмы. Приготовьте раствор автоклавного 10% поливинилацетата или ПВА и используйте 500 микролитров его, чтобы тщательно покрыть носители образцов. Дав им высохнуть на воздухе в течение четырех часов, с помощью стерильных щипцов снимите высушенный слой ПВА, который теперь содержит образец споры, и перенесите его в реакционную пробирку объемом 2 миллилитра.

Добавьте один миллилитр стерильной воды в пробирку и сделайте ее вихревой, чтобы растворить слой ПВА и восстановить более 95% спор, способных к прорастанию. Используйте стерильную воду для последовательного разбавления образца в соотношении от одного до 10 в 96-луночном планшете. После нанесения 50 микролитров каждого разведения на LB-агар и инкубации при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи, подсчитайте количество колоний и определите КОЕ на миллилитр.

Для экспериментов по проращиванию приготовьте агаровую прокладку толщиной 1,5 миллиметра толщиной 1,5 фунта, вскипятив 700 микролитров среды, и измельчите ее пипеткой в стерильную микроскопическую прокладку. Через 10 минут с помощью стерильного скальпеля вырежьте агаровую подушечку размером восемь миллиметров на восемь миллиметров на один миллиметр и осторожно перенесите агар поверх споровых монослоев, которые лежат на 25-миллиметровых стеклянных защитных листах, уже установленных в камере визуализации. Метод агарового пут-опциона сочетает в себе две специфические функции.

Он стабилизирует образцы в оптической плоскости во время лазерной микроскопии и ограничивает боковое движение клеток. Помимо использования его для эссе о проращивании, этот метод может быть применен как к другим микроорганизмам, так и к эукариотическим клеткам. Накрыв образец агаром, быстро перенесите стеклянную крышку в камеру для визуализации.

Держите образец при температуре 37 градусов Цельсия на нагретом столике в течение всего процесса визуализации. Используйте не менее трех биологических репликатов для каждого состояния. После получения изображений образцов с помощью автоматизированного конфокального лазерного сканирования и светлопольной микроскопии запишите серию таймлапсов с мощностью лазера 2,6% и установите конфокальную апертуру на пять единиц aer и частоту выборки один кадр в 30 секунд от нуля до пяти часов в зависимости от эксперимента.

Применение высоких доз монохроматического света может полностью ингибировать прорастание спор во время лазерной микроскопии. Поэтому используйте интенсивность лазера и просто более длинные интервалы для получения одиночных кадров. В случае агрегации спор, многослойного распределения спор или загрязнения частицами пыли, может произойти блокирование плазменной обработки или затенение, что приведет к прорастанию затененных спор.

Для проведения сканирующей электронной микроскопии, после того как монослои спор были закодированы золотым палладием, визуализируйте образцы с помощью полевой эмиссионной СЭМ, работающей при напряжении ускорения в пять киловольт, включая встроенный детектор вторичных электронов для выявления контраста топографии. Как показано на этом графике, плазменная обработка спор B.subtilis приводит к снижению выживаемости с увеличением продолжительности плазменной обработки. Эти снимки СЭМ показывают характерные продольные гребневидные структуры, которые постоянно видны во всех обработанных и необработанных спорах.

Плазменная обработка продолжительностью до 30 секунд не вызывает существенных изменений морфологии поверхности спор по сравнению с контролем. Увеличение продолжительности плазменной обработки приводит к более зернистой поверхности, а в спорах, обработанных в течение 120 или 240 секунд, могут наблюдаться небольшие трещины и трещины. За это время были разрешены эксперименты с помощью конфокальной лазерной сканирующей микроскопии, почти все споры, обработанные вакуумом в качестве контроля, прорастают и развивают палочковидную морфологию клеток с достаточно равномерной длиной отдельных клеток.

Напротив, споры, обработанные плазмой в течение 15 секунд, уже демонстрируют сниженную всхожесть менее чем на 75 плюс-минус четыре процента. Кроме того, клетки вырастают либо в обширно длинные стержни, либо остаются маленькими и прилипают в споровой оболочке. После 30 секунд обработки плазмой прорастает только 25 плюс-минус шесть процентов спор, а вегетативные клетки заметно задерживаются в росте и различаются по длине.

При попытке выполнить эту процедуру важно подтвердить качество монослоев спор с помощью фазово-контрастной микроскопии, чтобы убедиться в отсутствии перекрывающихся или прорастающих спор. После своего развития метод стабилизации изображения с помощью агаровой прокладки проложил путь исследователям в области стерилизации плазмы и микроскопии живых клеток. После просмотра этого видео вы должны лучше понять, как препарировать монослои спор на предметных стеклах, определить целесообразность использования плазменных обработок для инактивации спор и провести живую клеточную и сканирующую электронную микроскопию.

В отличие от других методов обеззараживания, например, окиси этилена или гамма-излучения, плазменная стерилизация является эффективным и безопасным подходом для уменьшения количества нежелательных микроорганизмов практически на любой поверхности.