Вызывая Cre-lox рекомбинации в мыши головного мозга путем электропорации в утробе матери

Общая цель этой процедуры заключается в создании генетической мозаики в коре головного мозга мыши путем индуцирования рекомбинации Cre-Lox с помощью внутриутробной электропорации. Этот метод создания генетической мозаики может помочь ответить на ключевые вопросы нейробиологии. Например, определение того, необходим ли ген для данного нейронного фенотипа автономным способом в клетке.

Основное преимущество этой методики заключается в том, что эффективная система рекомбинации Cre-Lox сочетается с не менее эффективной методикой доставки генов при внутриутробной электропорации. Хотя этот метод ориентирован на нейроны второго или третьего слоя коры, он может быть использован для нацеливания на нейроны в других слоях коры. Когда мы попытались создать генетическую мозаику в ткани нашего мозга, мы столкнулись с рядом проблем, пытаясь заставить наших подопытных животных выжить после рождения, поэтому мы внесли несколько упрощений и усовершенствований в нашу технику.

Подготовьте пипетку с очень длинным конусом и очень тонким наконечником, типичным для пипеток для инъекции эмбриональных стволовых клеток или переноса ядра, предварительно вставив стеклянный капилляр в пуллер пипетки. После крепления зажимов активируйте программу по протоколу вытягивания, создав конус на стеклянном капилляре. Убедитесь, что длина конуса составляет от 10 до 15 мм с помощью микроскопа с составной подсветкой.

Далее, чтобы сломать кончик центра пипетки, однослойной задачей протрите стакан объемом 50 мл и туго растяните его одной рукой. Другой рукой протолкните вытянутую пипетку конической стороной вниз, перпендикулярно через центр салфетки, вызывая чистый разрыв конуса. Проверьте размер отверстия под сложным световым микроскопом.

Затем откалибруйте пипетку, отасунув 1 мкл 0,4%-ного трипанового синего и PBS в частично заполненную пипетку, и градуируйте пипетку с маркировкой 1 мкл в зависимости от высоты 1 мкл в пипетке. Используйте откалиброванную пипетку для градуирования других вынутых пипеток перед утилизацией. Поместите пипетки в держатель пипетки без пыли и других частиц.

После глубокой анестезии беременной мыши на уровне Е-15.5 проверьте рефлекс выпрямления, осторожно наклонив индукционную камеру и наблюдая за реакцией мыши. Если выпрямляющий рефлекс отсутствует, перенесите мышь в область хирургической подготовки и введите ингаляционный изофлуран через носовой конус для поддержания хирургической плоскости анестезии. С помощью щипцов проверьте рефлекс педали, чтобы убедиться в анестезии.

Следите за частотой дыхания при нагрузке, обращая внимание на то, чтобы дыхание было глубоким, регулярным и чтобы слизистые оболочки были розового цвета и увлажнены. Нанесите на глаза достаточное количество ветеринарной офтальмологической мази, чтобы полностью покрыть их для защиты от высыхания. Массирующими движениями нанесите крем для депиляции на область живота ватными палочками, пока шерсть на животе не растворится.

Затем сотрите шерсть на животе. Тщательно смойте остатки и крем для депиляции с помощью 70% этанола и ватных тампонов. Нанесите скраб на основе йода в область живота круговыми движениями.

Затем используйте хирургическую простыню, чтобы изолировать операционную область и поддерживать стерильные условия. После того, как вы сделаете 2-сантиметровый вентральный разрез по средней линии на коже, найдите белую линию, чтобы визуализировать среднюю линию прямой мышцы живота. Потяните мышцу вверх и в сторону от живота и сделайте разрез по средней линии шириной 2 см, чтобы обнажить брюшную полость с помощью асептических методов.

С помощью стерильного наконечника для микропипетки объемом 10 мкл введите карпрофен в брюшную полость для обезболивания. Далее зажмите один щипец для комаров Гартмана на левом краю разреза прямой мышцы живота. Упритесь щипцами в перевернутую чашку Петри слева от разреза, держа левую сторону разреза открытой.

Зажав правую сторону разреза аналогичным образом, поместите марлевую губку вокруг области разреза. С помощью кольцевых щипцов без прикрепленного ограничительного винта потяните матку между любыми двумя соседними эмбрионами, не раздавливая и не травмируя ткани. Начните вытаскивать все эмбрионы через разрез, положив их поверх марлевой губки.

Подсоедините калиброванную пипетку к аспирационной трубке в сборе и введите ровно 1 мкл приготовленного раствора ДНК через стенку матки в боковой желудочек каждого эмбриона. Используйте большой и указательный пальцы для манипуляций с эмбрионами, позволяя эмбрионам мягко прижиматься к стенке матки во время инъекции. Боковые желудочки выглядят как два более темных пятна на дорсальном конечном мозге эмбриона.

Подтвердите успешную инъекцию, наблюдая за заполнением бокового желудочка Трипановым синим. После введения всех эмбрионов поместите катод электродов типа пинцера на матку, непосредственно над медиальной и каудальной корой, чтобы нацелиться на зрительную кору. Расположите анод чуть ниже и спереди от головы эмбриона.

С помощью ножной педали запускайте подачу импульсов длительностью 550 мс по 50 вольт, разделенных интервалом 950 мс. После электропорации всех эмбрионов вернуть матку в брюшную полость в той же ориентации, в которой она была обнаружена. Используйте физиологический раствор для смазки матки, направляя ее вручную и очень осторожно, стараясь не сместить эмбрионы с их места в матке.

Закройте мышцы живота рассасывающимися швами. Используйте простой прерывистый стежок, завязав концы хирургическим узлом. Закройте слой кожи рассасывающимися швами.

Нанесите небольшое количество тканевого клея, чтобы запечатать рану. Нанесите на узлы тканевый клей, чтобы предотвратить расстегивание. С помощью микропипетки удалите любой тканевый клей вокруг раны, который может быть аспирирован

Как только тканевый клей высохнет, удалите животное из изофлурана и дайте самке восстановиться в одиночестве в теплой клетке. Продолжайте следить за мышью до тех пор, пока она полностью не восстановится и не будет вести себя нормально. После снятия поместите самку обратно в клетку с самцом.

Поместите череп на ровную поверхность с помощью однослойных салфеток, смоченных 1-х ПБС. С помощью пинцета сначала удалите затылочную кость. Затем осторожно удалите теменные кости, вынув пинцет наружу и в сторону от поверхности мозга.

Осторожно удалите все мозговые оболочки, чтобы не повредить кору головного мозга. Вклините заднюю часть пинцета под мозг вдоль черепа, чтобы разорвать любые черепные нервы и удалить мозг. С помощью лезвия бритвы с одним лезвием сделайте корональный разрез примерно на 0,5 мм рострально до брегмы, а другой корональный разрез примерно на 0,5 мм каудально от интересующей ткани.

Тканевый блок теперь готов к секционированию. Инъекция 1 мкл 2 мг/мл GFP Cre приводит к разреженному распределению меченых клеток, некоторые из которых могут быть яркими. Поскольку ткань разрезается на 100 микрон, большая часть дендритных арборов сохраняется.

Когда внутриутробная электропорация проводится на 15,5-й день эмбрионального периода, мечение происходит во втором и третьем слоях коры головного мозга. Дендритные шипы можно наблюдать при больших увеличениях. Введение 1,5 мкл 2 мг/мл GFP Cre приводит к очень плотному мечению, которое может быть неоптимальным, поскольку трудно отследить источник нейритов и дендритных шипов.

Однако, выбрав яркую клетку на периферии размеченной области, все еще можно визуализировать нейрон и его процессы. С другой стороны, инъекция конструкций SuperNova приводит к разреженному распределению нейронов второго или третьего слоя, которые очень ярко помечены. После освоения операция внутриутробной электропорации займет менее 30 минут, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру с другими конструкциями ДНК, важно помнить о том, что нужно пробовать разные концентрации и объемы, это поможет достичь желаемой разреженности мечения, необходимой для мозаичного анализа. В наших репрезентативных результатах использовалась либо одна конструкция, либо недавно изобретенная конструкция SuperNova. В последнем случае мы обнаружили, что можем добиться превосходной разреженной маркировки, максимизируя при этом яркость нейронов.

Этот метод может быть адаптирован для создания мозаичной ткани мозга другими способами. Например, редактирование генов CRISPR и Cas9 можно сочетать с внутриутробной электропорацией, или рекомбинацию Cre-Lox можно сочетать с внутрижелудочковым введением вирусных векторов. После просмотра этого видео вы должны иметь хорошее представление о нескольких упрощенных и усовершенствованных методах, используемых для достижения разреженной генетической мозаики, чтобы вы могли сочетать рекомбинацию Cre-Lox и внутриутробную электропорацию вместе.

Мы желаем вам удачи.