Assay простой Cell-based иммунофлюоресценции для выявления аутоантител против рецептора N-метил D-аспартат (NMDA) в крови

Общей целью данного анализа является выявление аутоантител против рецептора NMDA в крови пациентов с подозрением на аутоиммунный энцефалит. Мера помогает ответить на ключевые вопросы дифференциальной диагностики пациентов с острой нервно-психической симптоматикой. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она является простой и надежной мерой скрининга.

Начните эту процедуру с подготовки покрытых желатином культуральных пластин. Аликвот 200 мкл 2%-ного раствора желатина в каждую лунку 48-луночного культурального планшета и инкубируйте планшет при температуре 37 градусов Цельсия не менее 30 минут. Через 30 минут отсасывайте желатиновый раствор из лунок.

Засейте в каждую лунку 5 раз по 10 до 4-х клеток HEK293 в 200 мкл клеточной питательной среды, содержащей 10% FBS. Инкубируйте планшет в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия во влажном инкубаторе с 5% углекислым газом. На следующий день замените отработанную питательную среду в каждой лунке 200 микролитрами свежей питательной среды, содержащей 10% FBS.

Увеличивая масштаб в соответствии с общим числом лунок в эксперименте, приготовьте раствор А путем смешивания плазмиды NR1-GFP с питательной средой. Приготовьте раствор В, смешав реагент для трансфекции с питательной средой. Приготовьте раствор С, смешав раствор А и раствор В и инкубируя смесь при комнатной температуре в течение 20-30 минут.

Далее внесите 40 микролитров раствора С в каждую лунку, содержащую ячейки HEK293. Осторожно поверните тарелку и инкубируйте ее при температуре 37 градусов Цельсия в увлажненном инкубаторе с 5% углекислым газом на ночь. Проверьте экспрессию рекомбинантного белка NR1-GFP в клетках-хозяевах под флуоресцентным микроскопом с увеличением от 40 до 200 раз, прежде чем приступать к клеточному иммунофлуоресцентному анализу.

Чтобы начать этот анализ, сначала отсадите отработанную среду из лунок культуральной тарелки, а затем промойте каждую лунку 200 микролитрами PBS три раза. Добавьте в каждую лунку по 200 микролитров 4%-ного раствора параформальдегида и выдержите тарелку при комнатной температуре в течение 15 минут. Отсадите раствор параформальдегида из лунок и промойте каждую лунку 200 микролитрами PBS три раза.

Далее в каждую лунку добавьте по 200 микролитров 10%-ного обезжиренного молока в растворе ПБСТ и выдержите тарелку при комнатной температуре с легким встряхиванием в течение одного часа. Отсадите из лунок 10%-ное обезжиренное молоко в растворе ПБСТ и однократно промойте лунки 200 микролитрами ПБСТ. Инкубируйте лунки с плазмой, разведенной от одного до 100 в PBST в качестве основного антитела, с легким встряхиванием при комнатной температуре в течение одного часа.

Через час отсадите разведенную плазму из лунок и промойте каждую лунку 200 микролитрами PBST три раза. В каждую лунку добавьте по 200 микролитров козьего античеловеческого IgG, конъюгированного с Alexa Fluor 594 и инкубируйте культуральную пластину при комнатной температуре с легким встряхиванием в течение одного часа. Затем аспирируйте козу античеловеческий IgG, конъюгированный с раствором Alexa Fluor 594, и промойте каждую лунку 200 микролитрами PBST три раза.

После третьей промывки PBST добавьте в каждую лунку по 100 микролитров раствора глицерина, содержащего DAPI. Наблюдайте и визуализируйте клетки под флуоресцентным микроскопом, используя правильный фильтр для каждого красителя и окуляр с 10-кратным, 10-кратным и 20-кратным объективами. На этих репрезентативных изображениях, сделанных через 24–30 часов после трансфекции, видны клетки HEK293, экспрессирующие NR1-GFP.

Примерно 30% клеток имели зеленый сигнал под флуоресцентным микроскопом. На соответствующих изображениях Alexa Fluor 594 красный сигнал на панели B указывает на связывание аутоантител анти-NMDA-рецептора с NR1, экспрессируемым в клетках HEK293. Слабый красный сигнал на панели E указывает на фоновый шум изображений Alexa Fluor 594.

Клетки, экспрессирующие NR1-GFP, были использованы для скрининга наличия аутоантител к анти-NMDA-рецепторам в образце плазмы крови человека. На этих объединенных изображениях желтый цвет указывает на колокализацию аутоантител NR1-GFP и анти-NMDA-рецептора. Стрелками показаны примеры клеток с выраженной колокализацией.

Образец плазмы, который показывает перекрытие зеленого и красного сигналов более чем на 30%, будет интерпретирован как положительный в этом случае. На объединенном изображении отрицательного контроля наблюдается небольшое перекрытие зеленого и красного сигналов, что подтверждает специфическое связывание аутоантител анти-NMDA-рецептора с NR1-GFP в анализе. После освоения техника может быть выполнена за четыре часа, если она выполнена правильно.

Пробуя эту технику, важно помнить, что это всего лишь мера скрининга. После этих процедур могут быть выполнены другие меры, такие как вестерн-блоттинг и анализ тканей, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как специфичность положительных случаев. После разработки этот метод проложил путь исследователям в области психиатрии к изучению дифференциальной диагностики пациентов с острой чрезвычайной ситуацией в области психического здоровья.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как проводить анализ на скрининг аутоантител против NMDA-рецептора в крови.