Тест на переносимость глюкозы внутрибрюшинного, измерение функции легких и фиксации легких, для изучения последствий ожирения и нарушением метаболизма на легочных исходов

Общей целью следующих трех методов является изучение влияния ожирения и метаболических нарушений на структуру и функцию легких. Эти методы могут помочь ответить на ключевые вопросы в области респираторных исследований о влиянии метаболических нарушений на структуру и функцию легких. Преимущество этих методов заключается в том, что их можно комбинировать для оценки функциональной роли метаболизма в патогенезе хронических заболеваний легких и для тестирования различных терапевтических подходов.

Последствия этих методов выходят за рамки фенотипирования и выясняют специфическую функциональную роль метаболических мишеней в патогенезе заболеваний легких. Эти методы также могут быть применены для изучения структуры и функций как у здоровых животных с генетическими модификациями, так и на животных моделях ХОБЛ и астмы. Как правило, люди, плохо знакомые с этими методами, испытывают трудности, так как введение трахеальной трубки, инсуффляция легкого и введение глубокой анестезии, все они требуют опыта и подготовки.

Идея этих методов пришла нам в голову, когда мы обнаружили, что раннее ожирение у мышей, а также у людей тесно связано с воздействием на метаболизм и хроническими заболеваниями легких в младенческом возрасте. Чтобы измерить внутрибрюшинную толерантность к глюкозе, осторожно удерживайте взрослую мышь натощак в течение 12 часов за хвост и с помощью стерильных ножниц надрежьте кончик хвоста. Немедленно нанесите сыпучую каплю крови на тест-полоску глюкометра, чтобы измерить уровень глюкозы в крови натощак.

Результат теста появится на экране глюкометра через четыре секунды. После измерения уровня глюкозы для каждого животного пометьте их по отдельности цветными маркерами и взвесьте животных. Затем с помощью иглы 27-го калибра, прикрепленной к одномиллилилитровому шприцу, введите 100 микролитров глюкозы на тонну грамма массы тела каждому животному посредством внутрибрюшинной инъекции и измерьте уровень глюкозы в крови через 15, 30, 60 и 120 минут с помощью новых тест-полосок, как только что было продемонстрировано.

Чтобы оценить функцию легких, положите взрослую мышь в лежачем положении на подушечку и нанесите мазь на глаза животного. После подтверждения отсутствия реакции на защемление пальцев ног смочите шерсть в области щитовидной железы 70% этанолом и с помощью щипцов подтяните кожу по средней линии между яремной выемкой на грудине и бугровым симфизом ментума. С помощью тупых ножниц осторожно сделайте разрез кожи шириной в один сантиметр на коже тента, чтобы визуализировать подлежащую подкожную жировую клетчатку и щитовидную железу, и обнажить трахею с тщательным тупым разделением обеих долей щитовидной железы на перешейке и рассечением грудино-щитовидной и грудино-щитовидной мышц.

С помощью острых щипцов проденьте плетеный хирургический шов 4-0 между трахеей и пищеводом и осторожно разрежьте трахею, закройте гортань между хрящами трахеи микроножницами. Интубируйте с помощью трахеальной трубки, закрепив трубку хирургическим швом, и переместите животное на отапливаемую кровать камеры тела. Подсоедините трахеальную трубку к лицевой панели и включите аппарат искусственной вентиляции легких.

Подтвердите движение грудной клетки одновременно со скоростью вентиляции, чтобы убедиться в правильном размещении трахеальной трубки, и наблюдайте за сигналом давления на экране компьютера. Чтобы контролировать изменения транспульмонального давления во время вентиляции, вставьте пищеводную трубку на уровень легких, наблюдая за экраном, чтобы облегчить размещение трубки там, где можно наблюдать максимальное отклонение давления и минимальные сердечные артефакты. Начните сбор данных в соответствии с инструкциями производителя и нанесите на небулайзер 10 микролитров PBS.

Начните распыление через пять минут после восклицания, за которым следует трехминутная фаза реагирования, в течение которой измеряется сопротивление дыхательных путей и податливость дыхательной системы. Дайте животному восстановиться в течение трех минут перед началом следующего распыления и следуйте инструкциям программного обеспечения по поэтапному применению увеличивающейся концентрации метахолина на 10 микролитров на аппарате искусственной вентиляции легких. Для количественного гистоморфометрического анализа легочной ткани тупыми ножницами делают небольшой разрез в диафрагме взрослой мыши и изогнутыми тупыми ножницами делают перистернальный разрез по всей длине грудной клетки, чтобы аккуратно вскрыть грудную клетку.

Поднимите грудную клетку, чтобы обнажить плевральную полость и удалить тимус. После удаления сердца с помощью острых щипцов подготовьте и обнажите трахею, чтобы провести хирургический шов с оплеткой 4-0 между трахеей и пищеводом с последующим осторожным разрезом трахеи близко к гортани между хрящами трахеи. Интубируйте с помощью канюли для внутривенного введения 26-го калибра и используйте фиксирующее средство для надувания легких путем фиксации давления при постоянном давлении 20 сантиметров воды.

Через 30 минут при комнатной температуре перевязать трахею и одновременно удалить канюлю. Затем осторожно иссеките легкие, не повреждая ткани, и храните легкие в свежем фиксаторе при температуре четыре градуса Цельсия в течение ночи. У мышей с ожирением наблюдается повышение уровня глюкозы в сыворотке крови через 15 и 30 минут после внутрибрюшинного введения глюкозы, что указывает на нарушение усвоения глюкозы клетками по сравнению с мышами, которых кормили стандартной диетой.

Инвазивный анализ функции легких показывает до 1,5-кратного увеличения сопротивления дыхательных путей у мышей с ожирением и высоким содержанием жиров, которых кормили после стимуляции метахолином по сравнению с контрольными животными. Окрашивание гематоксилином и эозином срезов паренхимы легких после интратрахеальной установки выявляет множественные нераздутые участки, толстые альвеолярные перегородки и альвеолы многоугольной формы в легких, закапываемые при слишком малом давлении. Напротив, слишком большое давление при закапывании приводит к чрезмерно раздутым участкам с разрушенными альвеолярными перегородками.

Однако применение соответствующего давления во время фиксации легкого приводит к полному раздуванию легкого с альвеолами круглой формы. После освоения внутрибрюшинные тесты на толерантность к глюкозе можно пройти за два с половиной часа. Тесты функции легких могут быть завершены за один час, а инсуффляция легких может быть завершена менее чем за час.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить, что для оптимального сбора данных рекомендуется адаптировать мышей, обучать следователя и работать в тихой обстановке с низким уровнем стресса. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области метаболизма и респираторных заболеваний к изучению механизмов, участвующих в стратегиях лечения хронических заболеваний легких, и их потенции с использованием моделей мелких животных. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как исследовать влияние ожирения и метаболических нарушений на структуру и функцию легких.

Не забывайте, что работа с животными или хирургическими инструментами может привести к травмам или кожным реакциям, и что при выполнении этих процедур всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение соответствующих средств индивидуальной защиты.