Создание высокопроизводительного скрининга платформы для оценки гетерогенности амплификации гена HER2 в опухоли молочной железы
5 декабря 2017 г.
Гетерогенные распределение HER2-положительных клеток может наблюдаться в подмножестве рака груди и генерирует клинических дилеммы. Здесь мы представляем надежные и рентабельные протокол определить, количественно оценить и сравнить HER2 генетической гетерогенностью внутри опухоли в большой серии гетерогенно переработки молочной железы.
Общая цель этой лабораторной процедуры заключается в одновременном определении, количественной оценке и сравнении внутриопухолевой генетической гетерогенности HER2 в большой серии гетерогенных опухолей молочной железы с помощью высокопроизводительной гибридизации серебра in situ. Этот метод может помочь в выборе ключевых вопросов трансляции рака молочной железы и таких исследованиях, как изучение гетерогенности амплификации гена HER2, большая когорта случаев, извлеченных из архивов патологий. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет проводить высокопроизводительный шизоанализ HER2 в различных топографических областях множественных и гетерогенно обработанных раковых опухолей молочной железы.
Как правило, люди, не знакомые с гибридизацией in situ, испытывают трудности, потому что ретроспективные исследования обычно требуют анализа архивных образцов, которые подверглись различным процедурам фиксации, обработки и хранения. Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы решили реклассифицировать все виды рака молочной железы из нашей институциональной базы данных с 2003 года. Демонстрировать эту процедуру будет Джулия Эрколи, техник из нашей лаборатории.
Начните этот протокол с отбора пациентов и образцов тканей, как описано в текстовом протоколе. Создайте и откройте новый файл электронной таблицы, включающий записи отдельных областей каждого случая. Включите отдельные столбцы для идентификатора случая, идентификатора блока, идентификатора области, типа ткани, топографии, морфологии, статуса биомаркеров и всех других доступных иммуногистохимических характеристик.
Создайте проект TMA. Определите блоки-получатели PMA, перейдя в раздел Файл, Создать, Блокировать. Нажмите на первое поле для заполнения и введите размеры парафинового блока.
Затем создайте проект массива тканей, перейдя в раздел Файл, Новый, Массив тканей. Нажмите на иконку импорта, затем выберите файл шаблона ранее созданного блока-получателя. Нажмите далее.
Затем выберите один миллиметр в качестве размера пятна, нажав круглую кнопку. В качестве интервала между пятнами выберите 500 микрон, то есть пространство между двумя центрами соседних пятен. Затем нажмите на иконку калькулятора, чтобы рассчитать общее количество созданных пятен, которое должно быть 231.
Затем нажмите на кнопку Определить, чтобы создать сетки и подсетки. Исключить восьмую и 15-ю колонки и центральную строку. Сохраняйте три точки на первой линии для ориентации.
Итоговая карта должна охватить в общей сложности 183 места. Определите список типов тканей, перейдя к разделу Файл, Новый, Список типов тканей. Затем определите проект, перейдя в раздел Файл, Новый, Проект бустера.
Далее подготовьте блоки акцептора. Заполните очищенные металлические формы эластичным парафином при температуре 65 градусов Цельсия. Оставьте парафиновые блоки остывать при температуре пленки на ночь внутри металлических форм.
На следующий день извлеките парафиновые блоки из металлических форм. Создайте TMA с помощью автоматизированного или полуавтоматического устройства массива, сначала включив устройство массива, а затем вставив блоки приемки в карусель устройства массива. Определите начальное положение на каждом блоке-реципиенте с помощью клавиш со стрелками, чтобы переместить лазерный свет и выровнять его по верхнему левому краю парафина блока-реципиента.
Нажмите далее и повторите для вертикального выравнивания. Нажмите кнопку «Далее» еще раз, чтобы автоматически создать отверстие в ранее заданной координате блока-получателя. Опустошите пунш.
Расположите донорский блок для забора и удалите тканевый стержень из ранее аннотированной области интереса. Вставьте стержень донорской ткани в отверстие в реципиентном блоке. Затем удалите блок-донор из массивера.
Повторяйте эти шаги до тех пор, пока ТМА не будет завершена. Положите тканевую сторону только что сгенерированного блока ТМА на стерильное пустое предметное стекло и поместите их в лабораторную печь при температуре 45 градусов Цельсия на пять минут. Аккуратно надавите на блок на предметном стекле в течение пяти секунд, чтобы разровнять ядра ткани.
Повторите один раз, всего два раза. Затем покройте поверхность ткани ТМА тонким слоем эластичного парафина при температуре 65 градусов Цельсия. Оставьте блок ТМА при комнатной температуре на два часа.
Наконец, перенесите блок ТМА при температуре четыре градуса Цельсия в течение 24 часов перед выполнением гистохимического и иммуногистохимического анализов, как описано в текстовом протоколе. Поместите предметные стекла ТМА для анализа при температуре 60 градусов Цельсия на 10 минут. Затем запустите прибор и программное обеспечение для окрашивания иммунитета.
В окне просмотра на главной странице нажмите кнопку «Протоколы», а затем нажмите «Создать/изменить протоколы». Выберите процедуру двойного коктейля ISH, чтобы изменить базовый шаблон. Отметьте выпекание в списке коробок и установите температуру 63 градуса Цельсия на 20 минут.
Затем отметьте депарафинизацию. Следующий флаг кондиционирования ячеек в списке блоков. Затем отметьте кондиционирование клеток CC2 и установите температуру на уровне 86 градусов Цельсия и время инкубации на четыре минуты.
Слабый CC2 в течение восьми минут, стандартный в течение 12 минут и продленный на восемь минут. Отметьте ISH-Protease три в списке коробок и установите время инкубации на 16 минут. Выберите зонд HER2 динитрофенил и дигоксигенин хромосомы 17.
Инкубируйте в течение 16 минут, а затем установите денатурацию на 20 минут при температуре 80 градусов Цельсия. Установите время инкубации зонда на шесть часов. Затем установите время инкубации мультимера SISH на 32 минуты.
Установите хромат серебра и время инкубации на четыре минуты. Далее установите время инкубации красного мультимера на 24 минуты. Установите красный хромат и время инкубации на восемь минут.
Затем отметьте противоокрашивание в списке коробок, выберите гематоксилин два и установите время инкубации на восемь минут. Отметьте в списке коробок счетчик после окрашивания, выберите реагент для воронения и установите время инкубации в четыре минуты. Наконец, проведите шизоанализ на HER2.
Оценивайте амплификацию гена HER2 как положительную, если соотношение 17 зонда перечисления хромосом HER2 больше или равно 2,0 при среднем числе копий HER2 больше или равно 4,0 сигналам на клетку. Оцените как отрицательный, если коэффициент 17 зонда перечисления хромосомы HER2 меньше 2,0 при среднем числе копий HER2 менее 4,0 сигналов на клетку. Здесь представлены репрезентативные микрофотографии, показывающие анализ гибридизации серебра in situ гетерогенного рака молочной железы HER2
.В этом хрестоматийном примере две различные области инвазивного рака молочной железы высокой степени злокачественности без какого-либо специального типа показывают разные результаты с точки зрения амплификации гена HER2, визуализируемые в виде черных точек, по сравнению с центромерным зондом 17, визуализированным в виде красных точек. В частности, одна область, принадлежащая ядру опухоли и демонстрирующая нерегулярный рисунок окрашивания цитокератина 7, была амплифицирована HER2, в то время как на одном пятне перед инвазивным фронтом наблюдался рисунок HER2 дикого типа. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как проводить читаемый шизоанализ тканевых маркированных массивов, включающих множественные и гетерогенно обработанные раки молочной железы.
После освоения этой техники ее можно сделать за два рабочих дня с момента выбора кейса. Хотя этот метод оптимизирован для рака молочной железы, он может быть перенесен на другие типы рака, при которых гетерогенность HER2 критически важна, например, рак желудка. Применение этого метода распространяется на простую оценку HER2, поскольку он предназначен для всестороннего картирования множественных топографических областей в более крупных сериях раковых опухолей молочной железы.
Во время этой процедуры важно избегать трещин на блоке ТМА. Даже минимальная трещина в парафине позволяет сделать вывод о качестве, воспроизводимости и общей ясности гибридизации in situ. После этой процедуры может быть выполнена масс-спектрометрическая визуализация MALDI, чтобы ответить на дополнительные вопросы о протеомике рака молочной железы, особенно с точки зрения внутри- и межопухолевой гетерогенности.
Не забывайте, что работа с пуансонами ТМА и горячим парафином может быть опасной, поэтому при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение одноразовых нитриловых перчаток.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В данной статье представлен надежный и экономически эффективный протокол для определения, количественной оценки и сравнения внутриопухолевой генетической гетерогенности HER2 при раке молочной железы. Метод основан на использовании высокопроизводительной серебряной гибридизации in situ для решения клинических проблем, возникающих из-за гетерогенного распределения HER2-положительных клеток.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Исследование рака молочной железы
- Генетическая гетерогенность
- Методы гибридизации in situ
Теоретические основы
- HER2-положительные клетки характеризуются гетерогенным распределением при некоторых видах рака молочной железы.
- Эта гетерогенность создает трудности при принятии клинических решений.
- Существующие методы могут быть недостаточно эффективны для архивных образцов из-за различий в способах их обработки.
- Высокопроизводительные методы позволяют улучшить анализ большого количества образцов.
Цель исследования
- Разработать метод анализа гетерогенности амплификации гена HER2.
- Облегчить проведение исследований рака молочной железы с использованием большой когорты из патологоанатомических архивов.
- Повысить достоверность анализа HER2 в клинических условиях.
Используемые методы
- Высокопроизводительная гибридизация in situ с использованием серебра.
- Анализ большой серии случаев рака молочной железы.
- Сравнение генетической гетерогенности HER2 в различных областях опухоли.
- Использование архивных образцов с различной фиксацией и обработкой.
Основные результаты
- Данный метод позволяет эффективно количественно оценивать гетерогенность HER2.
- Высокопроизводительный анализ выявляет значительные вариации экспрессии HER2.
- Результаты могут быть использованы при принятии решений о лечении в рамках терапии рака молочной железы.
- Протокол adaptable для различных условий обработки образцов.
Выводы
- Данный протокол расширяет понимание гетерогенности HER2 при раке молочной железы.
- Он представляет собой ценный инструмент как для исследователей, так и для клиницистов.
- Будущие исследования могут опираться на этот метод для дальнейшего изучения терапии, связанной с HER2.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для индустрии
Гетерогенность HER2 при раке молочной железы затрудняет принятие решений о лечении и способствует вариативности клинических исходов, что создает потребность в стандартизированных и масштабируемых методах оценки. Данная высокопроизводительная платформа SISH позволяет проводить одновременный количественный анализ амплификации гена HER2 в нескольких топографиях опухоли и архивных образцах, что способствует доклинической валидации мишеней и стратификации биомаркеров. Обеспечивая воспроизводимое количественное картирование статуса HER2, данный метод повышает прогностическую достоверность в рабочих процессах раннего поиска и трансляционных исследований.
Стратегические области применения в биофармацевтических исследованиях и разработках
Ранние этапы поиска и валидация мишени
- Научная ценность: позволяет исследовать паттерны амплификации HER2 в различных областях опухоли для уточнения валидности мишени и её биологической значимости.
- Практическая ценность: способствует функциональному снижению рисков при выборе мишени путем количественной оценки внутриопухолевой генетической вариабельности в архивных когортах рака молочной железы.
- Прогностическая ценность: позволяет определять соотношение сигналов HER2/хромосома 17 и пороги числа копий для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки при выборе мишени.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: Создает стандартизированные форматы ТМА, оптимизированные для SISH, что позволяет проводить масштабируемый скрининг статуса HER2 в гетерогенных образцах.
- Количественные результаты: Предоставляет отношение HER2 к хромосоме 17 и среднее число копий HER2 на клетку в качестве измеряемых конечных точек для валидации анализа.
- Повторное использование платформы: Может быть адаптирована для других типов рака (например, рака желудка), где гетерогенность HER2 влияет на терапевтический ответ, что обеспечивает переносимость анализа между различными показаниями.
Трансляционные и доклинические исследования
- Трансляционная преемственность: позволяет отслеживать статус HER2 от этапа первичного исследования до доклинических моделей, сохраняя пространственную гетерогенность в FFPE-тканях.
- Согласованность биомаркеров: интегрируется с IHC для ER, PR, Ki67 и HER2, что обеспечивает мультимодальное профилирование биомаркеров в архивных когортах.
- Развитие с учетом рисков: выявляет HER2-отрицательные субпопуляции внутри формально HER2-положительных опухолей, что позволяет определять стратегии комбинированной терапии и механизмы резистентности.
Интеграция конвейеров и рабочих процессов
Данный метод вписывается в континуум от открытия до трансляции, позволяя проводить оценку гетерогенности HER2 после идентификации мишени и перед доклиническим тестированием эффективности, особенно при стратификации на основе биомаркеров.
- Фундаментальная биология: способствует проверке гипотез о паттернах амплификации HER2 и гетерогенности сигнальных путей в образцах первичных опухолей.
- Скрининг: обеспечивает воспроизводимость анализа за счет стандартизированного изготовления ТМА и выполнения протокола SISH для образцов с различной степенью обработки.
- Аналитика: предоставляет количественные показатели соотношения HER2/хромосома 17 и пороговые значения числа копий для объективного сравнения генетической гетерогенности.
- Трансляционные исследования: обеспечивает преемственность с доклинической работой, связывая пространственные паттерны HER2 с функциональными результатами в модельных системах.
- Корпоративное использование: создает масштабируемую стандартизированную платформу для оценки HER2, применимую для различных видов рака и архивных наборов образцов.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в путях, управляемых HER2, за счет разрешения внутриопухолевой генетической гетерогенности.
- Операционная ценность: Обеспечивает стандартизацию и воспроизводимость благодаря автоматизированному созданию массивов TMA и оптимизированным условиям SISH.
- Стратегическая ценность: Повышает эффективность принятия решений о продолжении или прекращении исследований (go/no-go), предоставляя количественные пороговые значения HER2 для стратификации пациентов в доклинических исследованиях.
- Влияние на портфель: Позволяет проводить приоритизацию кандидатов, нацеленных на HER2, с поправкой на риск путем идентификации опухолей с гетерогенными профилями амплификации.
Рекомендации по реализации
- Требуется опыт в создании тканевых микромассивов, проведении гибридизации in situ и анализе в области цифровой патологии.
- Зависимость от автоматических окрашивателей, приборов для создания ТМА и систем визуализации, способных регистрировать сигнал SISH.
- Необходима стандартизация между группами патоморфологов, молекулярных биологов и биоинформатиков для согласованной интерпретации данных.
- При сравнении сигналов HER2 в архивных образцах необходимо учитывать различия в фиксации, подготовке и хранении.
- Метод ограничен оценкой амплификации HER2 на уровне ДНК; без дополнительных методов ИГХ или функциональных тестов он не позволяет определить экспрессию белка или сигнальную активность.
Часто задаваемые вопросы о биофармацевтике
Chapters in this video
0:05
Title
1:24
Design and Construct Tissue Microarrays (TMAs) Based on the Kononen Technique
6:20
Silver In Situ Hybridization (SISH) Analysis of Human Epidermal Growth Factor Receptor 2 (HER2)
9:11
Results: Analysis of Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers
10:00
Conclusion
