Переходных выражение иностранных генов в клетках насекомых (sf9) для функциональных Assay протеина

Общая цель этой системы экспрессии белков, вызванных тепловым шоком, состоит в том, чтобы оценить антиапоптотическую активность белка в двух потенциально функционально антагонистических белках в клетках насекомых. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о функциях и активности белков-кандидатов в биотехнологии и протеомике, таких как их антиапоптотическая активность и белковые взаимодействия. Основное преимущество этой методики заключается в том, что время экспрессии генов контролируется индукцией теплового шока.

Таким образом, этот метод может дать представление о функциональном состоянии белка. Он также может быть применен к другим системам, таким как экспрессия белка млекопитающих. Клетки насекомых Spodoptera frugiperda, или Sf9, используемые в этом протоколе, выращиваются в среде для клеточных культур площадью 25 квадратных сантиметров при температуре 28 градусов Цельсия.

Встряхните колбу с клеточными культурами, чтобы отделить клетки от колбы. Затем проверьте под световым микроскопом, чтобы убедиться, что около 80% клеток отделены. Перенесите 50% клеточной суспензии в новую колбу для клеточных культур площадью 25 квадратных сантиметров и дайте клеткам прикрепиться при комнатной температуре в течение 15 минут.

Через 15 минут замените среду пятью миллилитрами свежей питательной среды, и выращивайте в инкубаторе при температуре 28 градусов Цельсия. В зависимости от роста клеток, пролетают клетки каждые два-три дня. Перед забором клеток Sf9 важно проверить клетки под световым микроскопом, чтобы убедиться в отсутствии загрязнения бактериями или другими микроорганизмами.

Чтобы собрать клетки Sf9, встряхните колбу с культурой, чтобы отделить клетки, а затем перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку. С помощью пипетки Р10 перенесите 10 микролитров клеточной суспензии в гемацитометр, и подсчитайте количество клеток под световым микроскопом. Поместите три раза по 10 на пятую ячейку в каждую лунку 24-луночного планшета и оставьте при комнатной температуре на 15 минут.

Через 15 минут замените среду на 0,5 миллилитра гальванической среды. Подготовьте регентскую трансфекцию клеток. Для каждой трансфекции разведите восемь микролитров реагента для трансфекции клеток со 100 микролитрами бессывороточной среды для клеточных культур и перемешайте в течение одной секунды.

В этом исследовании три различных усечения бакуловирусного гена, ингибитора апоптоза 3, или IAP3, будут экспрессироваться под контролем промотора теплового шока 70 дрозофилы, полноразмерного IAP3, усечения без домена RING и усечения без домена BIR. Добавьте по два микрограмма ДНК каждой плазмиды в 100 микролитров бессывороточной среды для культивирования клеток и перемешайте путем вортексирования в течение одной секунды. Подготовьте также положительный контроль.

Соедините разбавленную плазмидную ДНК и разведенный реагент для трансфекции клеток и перемешайте путем вортексирования. Выдерживать при комнатной температуре в течение 30 минут. С помощью пипетки P1000 добавьте по каплям в клетки по 210 микролитров каждой смеси реагентов для трансфекции ДНК.

Выдерживать при температуре 28 градусов Цельсия в течение пяти часов. Через пять часов замените гальваническую среду на 0,5 миллилитра среды для клеточных культур, а затем заклейте 24-луночный планшет скотчем. Инкубируют при температуре 28 градусов.

На следующий день тепловой шок для стимуляции экспрессии белка путем погружения тарелки в водяную баню при температуре 42 градуса Цельсия в течение 30 минут. Через 30 минут верните 24-луночный планшет в инкубатор с температурой 28 градусов Цельсия. Экспрессия белка впоследствии подтверждается вестерн-блоттингом, как описано в текстовом протоколе.

Чтобы изучить индуцированный генами апоптоз клеток, сначала подготовьте клетки Sf9, как было показано ранее. Затем трансфектируйте клетки тем же способом, что и раньше, но включите в каждую реакцию трансфекции один микрограмм плазмиды, содержащей ген-индуктор апоптоза. Инкубируйте при температуре 28 градусов Цельсия в течение пяти часов, замените среду и инкубируйте в течение 16 часов.

Подвергнуть трансфицированные клетки тепловому шоку при температуре 42 градуса Цельсия в течение 30 минут. Инкубируйте клетки при температуре 28 градусов Цельсия в течение пяти часов перед проведением анализа жизнеспособности клеток. Для апоптоза клеток, вызванного химическими веществами, поместите один раз в 10-6 клеток Sf9 в каждую лунку шестилуночного планшета.

Оставьте при комнатной температуре на 15 минут, а затем замените среду одним миллилитром гальванической среды. Трансфектируйте клетки четырьмя микрограммами каждой плазмидной ДНК. Через пять часов замените среду для нанесения покрытий одним миллилитром среды для культивирования клеток и инкубируйте клетки при температуре 28 градусов Цельсия в течение 16 часов.

Затем тепловой шок при температуре 42 градуса по Цельсию в течение 30 минут. Инкубируйте клетки при температуре 28 градусов Цельсия в течение пяти часов после теплового шока. Затем обработайте трансфицированные клетки актиномицином D, чтобы вызвать апоптоз.

Инкубировать при температуре 28 градусов Цельсия в течение 16 часов перед проведением анализа жизнеспособности клеток. Начните эту процедуру с промывания обработанных клеток. Достаньте среду из каждой лунки, добавьте по одному миллилитру PBS и оставьте на одну минуту.

Таким образом трижды промойте клетки PBS. Повторно суспендируйте клетки в каждой лунке одним миллилитром PBS, содержащим 04% трипанового синего, и окрашивайте при комнатной температуре в течение трех минут. Переложите клеточную суспензию в микрофуговую пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Перенесите 10 микролитров трипановой суспензии окрашенных в синий цвет клеток в гемацитометр и подсчитайте жизнеспособные интактные клетки под световым микроскопом. Наконец, выполните статистический анализ, как описано в текстовом протоколе. Полная длина и два усечения IAP3 из Lymantria xylina MNPV были сверхэкспрессированы в клетках Sf9, и для подтверждения экспрессии белка был проведен вестерн-блоттинг на клеточных лизатах.

Антиапоптотический белок Ac-P35 был включен в качестве положительного контроля. Все белки могут быть обнаружены в трансфицированных клетках через час или через пять часов после теплового шока, с более высокой экспрессией через пять часов. Эта система может быть адаптирована для оценки антиапоптотической активности.

Для ген-индуцированного клеточного апоптоза индуктор апоптоза Drosophila Reaper был котрансфицирован с плазмидными конструкциями-мишенями в клетки Sf9, которые впоследствии подвергались тепловому шоку для активации экспрессии генов. По сравнению с вектором Drosophila Reaper, положительный контроль показал высокую антиапоптотическую активность, достигающую до 80% жизнеспособности. Другие конструкции показали различные эффекты на антиапоптотическую активность.

При химически индуцированном апоптозе клеток только одна конструкция была трансфицирована в клетки Sf9, а актиномицин D был добавлен через пять часов после теплового шока. По сравнению с положительным контролем или отрицательным контролем, другие конструкции показали различное влияние на антиапоптотическую активность. После освоения этой техники ее можно сделать за два-три дня, если она выполнена правильно.

При проведении этой процедуры важно помнить о соблюдении правил работы клеточной культуры в ламинарном потоке и тщательно проверять состояние клеток. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как ко-иммунопреципитация, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, существует ли какое-либо взаимодействие между двумя белками, совместно экспрессирующимися в клетках насекомых. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области биотехнологии к изучению белковых функций у животных или микроорганизмов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как использовать эту систему для экспрессии чужеродного белка или оценки потенциально функционально антагонистических белков в клетках насекомых. Не забывайте, что работа с некоторыми химическими веществами, такими как актиномицин D, может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение перчаток.