Субретинальное трансплантации эмбриональных стволовых клеток человека производные сетчатки пигментного эпителиальных клеток в большой eyed модель географической атрофии

Общая цель этой процедуры заключается в создании модели географической атрофии у животных с большими глазами для трансплантации человеческих эмбриональных клеток пигментного эпителия сетчатки в глаз и оценки интеграции донорских клеток с помощью оптической когерентной томографии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области регенеративной медицины, такие как лечение дегенеративных заболеваний на основе стволовых клеток. Основным преимуществом этой хирургической установки является неограниченный источник здоровых клеток и хирургическая установка для субретинальной инъекции, которая имеет много общего с процедурой, предназначенной для пациента.

Применение этого метода распространяется на терапию возрастной макулярной дегенерации путем экспонирования клеток пигментного эпителия сетчатки, полученных из эмбриональных стволовых клеток человека. Наш зоотехник Моника Аронссон держит кролика в нужном положении, чтобы мы могли визуализировать и визуализировать сетчатку глаза с помощью оптической когерентной томографии. После обезболивания кролика согласно текстовому протоколу поместите кролика под операционный микроскоп головой к хирургу.

Затем используйте втягивающее средство для век, чтобы удалить веки, и стерильную салфетку, чтобы удалить мембрану никтитана. Для микрохирургии используйте двухпортовую или дополнительную трехпортовую технику 25-го калибра transvitreal pars plana с бесклапанными троакарами для введения микрохирургических инструментов. Многофункциональный витрэктомии имеет порты для подключения инфузионной канюли, эндоиллюминатора, витректора и эндолазера.

Для субретинальных инъекций обязательна только эндоиллюминация, что делает достаточной двухпортовую установку. С помощью сгустковых щипцов захватить и сместить конъюнктиву, обвести место введения. Транссклярно вставьте один из двух верхних троакаров, расположенный в одном-двух миллиметрах от лимба, под параллельным углом от тридцати до сорока пяти градусов.

Приступайте к вставке троакара в середину наконечника. Затем поверните троакар на девяносто градусов и продвинуте его в глаз, целясь в задний полюс. Это предотвратит послеоперационную утечку из этой склеротомии, а также снизит риск эндофтальмита.

Повторите то же самое со вторым верхним троакаром. При установке троакара важно находиться на расстоянии одного-двух миллиметров от лимба, чтобы туннелировать введение, и нацеливаться на задний полюс, чтобы свести к минимуму риск инфекции, кровотечения из стекловидного тела, отслоения сетчатки и прикосновения к линзе. Нанесите синтетические слезы в виде контрактного геля на роговицу, затем поместите одноразовую плоскую контактную линзу на роговицу, чтобы визуализировать сетчатку.

Затем капните пятьсот микролитров йодата натрия в одномиллилилитровый шприц, соединенный с удлинительной трубкой, управляемой ассистентом, и канюлей 38-го калибра с поликончиками, управляемой хирургом. Вставьте эндоиллюминационный щуп через верхний левый троакар. Затем вставьте канюлю для инъекции через верхний правый троакар и продвигайте канюлю через стекловидное тело к сетчатке, целясь в область чуть ниже диска зрительного нерва.

Позвольте кончику канюли медленно касаться сетчатки глаза, пока не станет заметно очаговое отбеливание. Не позволяйте канюле проникать в сетчатку, так как это может вызвать кровотечение. Теперь, проникнув иглой в сетчатку глаза, введите пятьдесят микролитров йодата натрия субретинально в течение пяти секунд

Поскольку между сетчаткой и подлежащей сосудистой оболочкой существует естественная плоскость расщепления, во время инъекции должен постепенно формироваться хорошо видимый полупрозрачный пузырь. Во время инъекции медленно втягивайте иглу, но следите за тем, чтобы кончик оставался в пределах пузырька, чтобы свести к минимуму рефлюкс. После удаления эндоиллюминации и инъекционной канюли используйте сгустковые щипцы для удаления троакаров.

Затем с помощью кончика или тупого конца щипцов слегка надавите в течение тридцати секунд на мягкую бесшовную склеротомию. Во время выздоровления ухаживайте за животным в соответствии с текстовым протоколом и ждите пересадки семь дней. Через семь дней после введения йодата натрия и последующего введения интравитреального триамцинолона, согласно текстовому протоколу, удалить среду для дифференцировки клеток из двадцати четырех лунок сливающегося монослоя hESC-RPE и использовать пятьсот микролитров PBS без кальция и магния для промывания каждой лунки.

После трипсинизации клеток наклоните пластину и осторожно удалите трипсин, чтобы клетки оставались прикрепленными к пластине. Соберите клетки в восемьсот микролитров свежей предварительно подогретой при температуре 37 градусов Цельсия среды для дифференцировки путем осторожного пипетирования или даже соскабливания при необходимости, чтобы получить суспензию для одной клетки. Используя ноль целых две десятых трипана синего, подсчитайте клетки в камере гемоцитометра в соответствии с инструкцией производителя.

Затем добавьте в клеточную суспензию пять миллилитров дифференцировочной среды и центрифугируйте клетки при трехсоткратном изгне, при комнатной температуре в течение пяти минут. Выбросьте надосадочную жидкость и повторно суспендируйте гранулу в только что отфильтрованном стерилизованном PBS в конечной концентрации одна тысяча клеток на микролитр. Аликвотируйте предыдущую клеточную суспензию в шестьсот микролитров аликвот и держите их на льду до и во время операции.

После обезболивания кролика и расширения зрачков согласно текстовому протоколу, поместите кролика головой к хирургу. Используйте втягивающее средство века, чтобы удалить веки, и стерильную салфетку, чтобы удалить мембрану никтитана. Для микрохирургии используйте двухпортовую или дополнительную трехпортовую технику трансвитреального pars plana 25-го калибра с троакарами, расположенными в тех же положениях, которые были продемонстрированы ранее в этом видео.

Если видны предыдущие склеротомии, выполните введение троакара непосредственно рядом с этими местами введения, но не через них, чтобы свести к минимуму риск послеоперационной утечки. Нанесите синтетические слезы на глаз, как и раньше, и поместите одноразовую плоскую контактную линзу поверх раствора на роговице, чтобы визуализировать сетчатку. Правильно расположив наконечник и нацелившись на центр предварительно обработанного йодатом натрия участка, отличающегося характерным металлическим эндопросветляющимся рефлексом, субретинально введите пятьдесят микролитров мягко перемешанной суспензии hESC-RPE.

Нейросенсорная сетчатка должна легко отделяться, создавая хорошо видимый пузырь. Во время инъекции медленно втягивайте иглу, но следите за тем, чтобы кончик оставался в пределах пузырька, чтобы свести к минимуму рефлюкс. После удаления эндоиллюминации и инъекционной канюли используйте сгустковые щипцы для удаления троакаров и тупым концом щипцов надавливайте на них в течение тридцати секунд, как и раньше.

Используйте устройство оптической когерентной томографии в спектральной области или SD-OCT с сопутствующим программным обеспечением для получения поперечных B-сканов обработанных животных в соответствии с инструкциями производителя. Поместите животное под наркозом и расширенным зрачком в регулируемое крепление, чтобы получить беспрепятственный путь от источника света инструмента к сетчатке кролика. Чтобы избежать размытия изображения, поддерживайте роговицу влажной, промывая ее местным физиологическим раствором каждые тридцать-шестьдесят секунд.

Получите не менее трех ОКТ-сканирований с помощью одновременной инфракрасной конфокальной сканирующей лазерной офтальмоскопии или эталонных изображений референс-референса конфокального SLO, представляющих верхнюю, центральную и нижнюю часть инъецируемой области. Одновременное получение нескольких лазерных цветов изображений глазного дна на лицевой стороне с конфокальным синим, зеленым, инфракрасным и многоцветным лазерным отражением SLO. Получение автофлуоресцентных изображений в синем свете с помощью лазера синего света устройства SD-OCT.

Здесь показаны репрезентативные изображения in vivo BAF, IR-cSLO и SD-OCT нормальной сетчатки кролика-альбиноса. Увеличенное изображение SD-OCT иллюстрирует различные слои сетчатки с их различными уровнями отражения света, улавливаемыми инструментом SD-OCT. Как показано на этом снимке SD-OCT, сделанном через три месяца после инъекции пятидесяти микролитров одного миллимолярного раствора йодата натрия, образуется пузырь, который рассасывается и постепенно дегенерирует внешнюю сетчатку.

Может наблюдаться истончение наружных слоев нейроретинальной сетки в областях SD-ОКТ и гипо-BAF, соответствующее потере РПЭ, таким образом, воссоздается ГА-подобный фенотип. После определения области повреждения пятьдесят тысяч клеток hESC-RPE были повторно введены для трансплантации, создав второй пузырь, который рассосался. Гипер-БАК легкой и умеренной степени тяжести присутствуют с очагально повышенным гипер-БАК на границе области поражения, что свидетельствует о хроническом стрессе нативного СВПХ.

Для сравнения показан пузырь, соответствующий введению hESC-RPE в глаза, не обработанные заранее, с указанием участков пигментных клеток на изображении МЦ и хорошо сохранившихся структур сетчатки на сканировании SD-ОКТ. Освоение этого довольно клинического метода субретинальной инъекции облегчит клиническую трансплантацию клеточного лечения таких состояний, как возрастная макулярная дегенерация. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как настроить субретинальные инъекции в модели типа жизни, как подготовить клетки, полученные из эмбриональных стволовых клеток человека, к субретинальным инъекциям и как визуализировать интеграцию донорских клеток с помощью оптической когерентной томографии.