С помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9 гена, редактирования для изучения онкогенных активность мутантов Calreticulin в зависимых Cytokine гемопоэтических клеток

Общая цель данного эксперимента заключается в использовании редактирования гена CRISPR/Cas9 для моделирования мутаций кальретикулина в цитокинзависимых кроветворных клетках с целью изучения их онкогенной активности. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гематологических злокачественных новообразований, такие как биологическая функция драйверных мутаций, когда они экспрессируются на физиологическом уровне. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он использует систему редактирования генов CRISPR/Cas9 для моделирования и изучения биологической функции генов, участвующих в раке.

Чтобы отжечь и фосфорилировать олигону, добавьте реагенты в общей сложности 10 микролитров в ПЦР-пробирку, хранящуюся на льду. Установите программу в термоамплификатор. Используйте воду для разбавления реакции после завершения цикла.

Для переваривания вектора lentiGuide-Puro приготовьте 50 микролитров дигестора реакции. Затем запустите реакцию пищеварения при температуре 55 градусов Цельсия в тепловом блоке. Через час добавьте еще микролитр фермента рестрикции BsmB1 и продолжайте реакцию еще час.

Чтобы дефосфорилировать разрезанную кость, добавьте в пищеварительный вектор семь микролитров буфера для реакции фосфатазы и два микролитра фермента фосфатазы. Затем инкубируйте смесь при температуре 37 градусов Цельсия в течение 30 минут. Очистите уже порезанный и дефосфилированный позвоночник с помощью коммерческого набора.

Чтобы приготовить смесь для лигирования, добавьте 15 нанограмм переваренной кости позвоночника и других реагентов в ПЦР-пробирку, хранящуюся на льду, и доведите объем до 10 микролитров водой. Инкубируйте реакцию при комнатной температуре в течение одного часа. Затем трансформируйте STBL3-совместимые клетки с помощью двух микролитров смеси лигирования.

А затем тарелку на лизогении бульона агаровой тарелки, содержащей 100 микрограмм на миллилитр ампициллина. После этого инкубируйте тарелку в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия. Выберите три колонии и привите их.

Проведите мини-подготовку для каждой культуры и секвенируйте место введения олиго с помощью праймера промоторной области U6. Засейте клетки hek293t на 10-сантиметровой тарелке. И оставьте его на ночь для инкубации.

Чтобы приготовить смесь ДНК для трансфекции, пипеткой впрыскивают в ДНК 45 микролитров реагента для трансфекции. С помощью пипетки тщательно перемешайте ДНК и реагент для трансфекции и дайте постоять 20 минут. После этого добавьте смесь для трансфекции ДНК по каплям на засеянные клетки.

Аккуратно перемешайте тарелки. И инкубировать при 5% углекислом газе и 37 градусах Цельсия в течение суток. Соберите содержащую вирус надосадочную жидкость через 24 и 48 часов, пропустив ее через фильтр с концентрацией 0,22 микрометра.

И по 1,6 миллилитров надосадочной жидкости в каждом криофлаконе. Затем аспирируйте надосадочную жидкость и ресуспендируйте клетки Ba/F3 в среде, пипетируя клетки вверх и вниз несколько раз. Добавьте 500 микролитров ресуспендированных клеток, 1,5 миллилитра вирусного надосадочной жидкости, четыре микролитра полибрена и 10 нанограммов на миллилитр мышиного интерлейкина 3 в шестилуночный планшет для культуры тканей.

Центрифугируйте планшет при 440 G в течение 120 минут при 37 градусах Цельсия. После центрифугирования перенесите планшет в инкубатор для ночной инкубации при температуре 37 градусов Цельсия с 5% углекислым газом. После этого вращайте ячейки при 440 G в течение трех минут.

И ресуспендировать в пяти миллилитрах свежей теплой среды в шестилуночной тарелке. Чтобы выбрать зараженные Cas9 клетки, сначала поверните ячейку вниз. А затем повторно суспендировать в свежих теплых средах с добавлением пяти микрограммов на миллилитр бластицидина после 48 часов обеззараживания.

Продолжайте отбор клеток в течение девяти дней с помощью бластицидина до тех пор, пока все неинфицированные клетки не умрут. Затем перенесите резистентные клетки в среду с одним микрограммом на миллилитр бластицидина. Трансдуцируйте родительские клетки и клетки, стабильно экспрессирующие Cas9, с помощью репортерной конструкции pXPR-011 через лентивирусную инфекцию.

Продолжайте отбор клеток с двумя микрограммами на миллилитр пуромицина в течение трех дней, 48 часов после заражения. Инфицируйте клетки, экспрессирующие Cas9, одной направляющей рибонуклеиновой кислотой с помощью лентивируса. Затем используйте два микрограмма на миллилитр пуромицина для отбора клеток в течение трех дней, 48 часов после заражения.

Сгруппируйте экспоненциально растущие клетки Ba/F3, экспрессирующие эктопический Cas9 и представляющую интерес единственную направляющую рибонуклеиновую кислоту. Отсадите надосадочную жидкость и промойте клетки пятью миллилитрами фосфатно-солевого буфера. Прижмите клетки вниз и трижды промойте фосфатным буфером.

Затем подсчитайте количество клеток с помощью анализатора жизнеспособности клеток. После этого затравочные клетки в трех количествах в двух миллилитрах свежей среды без интерлейкина 3 в шести лунках культуральных планшетов. Начинайте контролировать и подсчитывать клетки каждые два дня в течение восьми дней.

Здесь представлены психометрические данные репрезентативного потока, демонстрирующие активность Cas9 в родительских клетках Ba/F3 и гиперэкспрессию клеток Cas9 Ba/F3. Сигнал зеленого флуоресцентного белка снижен на 76% в клетках Cas9 с гиперэкспрессией Ba/F3, что указывает на высокую активность Cas9, тогда как в родительских клетках Ba/F3 сигнал зеленого флуоресцентного белка остается на уровне 100%Здесь показаны репрезентативные кривые роста для клеток, демонстрирующих онкогенную активность кальретикулина. Мутация со сдвигом рамки CRISPR/Cas9 плюс одна пара оснований со сдвигом рамки была введена в экзон 9 калретикулина с использованием m1 и m2 одиночной направляющей РНКазы.

Кривые роста клеток рецептора тромбопоиетина Cas9 кальретикулина, нацеленного на Ba/F3, показывают независимый рост интерлейкина 3 у мышей. Тем не менее, кривые роста для других типов клеток не показывают независимого от цитокинов роста. Результаты секвенирования подтверждают целенаправленное редактирование эндогинного экзона кальретикулина девять в клетках калретикулина, нацеленного на рецептор тромбопоэтина Ba/F3 Cas9 с использованием m1 и m2 одиночной направляющей РНКазы.

Мутации сдвига кадра плюс одна пара оснований обозначены черным цветом. После освоения этой техники ее можно выполнить за две недели при правильном выполнении. При проведении этой процедуры важно понимать, какие мутации в интересующем гене могут быть ответственны за желаемый фенотип.

После этой процедуры могут быть применены другие методы для дальнейшей характеристики мутации, такие как ее роль в передаче сигналов в клетках или во взаимодействиях белковых белков, чтобы лучше понять механизм, с помощью которого она вызывает заболевание. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области гематологии к изучению влияния мутаций усиления функции на физиологическом уровне на клеточную трансформацию в гемопоэтических клетках Ba/F3. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как использовать методологию редактирования генов CRISPR/Cas9 для исследования онкогенной активности мутаций в цитокин-зависимых гемопоэтических клетках.

Не забывайте, что работа с лентивирусом может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как работа в учреждении BL2 plus.