Сбор и извлечения образцов профессиональных воздуха для анализа ДНК, грибковых

Общая цель данной методики отбора проб воздуха и экстракции ДНК состоит в том, чтобы получить геномную ДНК грибов, которая может быть амплифицирована, секвенирована и таксономически размещена для выявления потенциальных грибковых опасностей в профессиональных условиях. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области оценки профессионального воздействия, например, какие грибковые опасности подвергаются работники и которые могут привести к негативным последствиям для здоровья. Основное преимущество этого метода заключается в том, что виды грибов, которые остаются необнаруженными с помощью методов культивирования или микроскопии, могут быть выяснены с помощью подходов, основанных на секвенировании.

Чтобы собрать кассету фильтра для отбора проб воздуха, поместите опорную прокладку для фильтра из целлюлозы на решетчатую поверхность основания элемента, затем с помощью фильтрующих щипцов поместите фильтр на верхнюю часть опорной прокладки фильтра стороной сбора вверх. После сборки загерметизируйте фильтрующую кассету, вставив удлинительный колпак и плотно и равномерно прижав его ручным или пневматическим прессом. Затем установите собранную кассету на верхнюю часть аэрозольного пробоотборника NIOSH и надавите как можно сильнее.

Используйте кусок 19-миллиметровой ленты, чтобы обернуть его вокруг внешней стороны фильтрующей кассеты и пробоотборника, удерживая фильтрующую кассету на месте и действуя как резервное уплотнение для предотвращения утечек. Плотно и полностью вкрутите пробирки для сбора пробирок в пробоотборник до тех пор, пока они не достигнут дна, и оберните пробирки уплотнительной лентой, действующей как вторичное уплотнение от утечки. Чтобы провести личный отбор проб аэрозоля, поместите пробоотборник в зону дыхания человека.

Прикрепите пробоотборник к лацкану, плечу или груди, а затем держите насос для отбора проб на уровне талии или в рюкзаке. Включите насосы и через минуту проверьте, работает ли насос. После завершения отбора проб воздуха соберите пробоотборник воздуха у испытуемого.

Снимите уплотнительную ленту, открутите трубки, а затем наденьте на них колпачок. Поместите третью часть фильтрующей кассеты над фильтром. Сначала протрите кассету для отбора проб 70%-ным этанолом, а затем с помощью инструмента для открытия кассеты откройте кассету для отбора проб во время работы в шкафу биологической безопасности класса II.

Затем с помощью подъемника фильтра поднимите опорную подушку и поднимите фильтр вверх. Затем с помощью фильтрующих щипцов снимите фильтр и поместите его в стерильную чашку Петри. Разрежьте фильтр на шесть равных частей стериловым скальпелем, а затем поместите их в двухмиллилитровую армированную трубку, содержащую 300 миллиграммов стеклянных шариков размером от 200 до 500 микрометров.

Погрузите содержащую фильтр трубку в жидкий азот на 30 секунд, а затем быстро поместите ее в гомогенизатор бисерной мельницы со скоростью 4,5 метра в секунду на 30 секунд. Добавьте 0,5 миллилитра буфера для лизиса в пробирки, содержащие оставшиеся мелкие кусочки неповрежденного фильтра, затем добавьте 0,3 миллилитра буфера для лизиса в пробирки для сбора пробоотборников воздуха объемом 15 и 1,5 мл и переведите пробирки в вертикальном и перевернутом положении в течение 10-15 секунд соответственно. Перенесите буфер для лизиса из каждой сборной пробирки в двухмиллилитровые армированные пробирки, содержащие 300 миллиграммов стеклянных шариков.

Обрабатывайте пробирки в гомогенизаторе бисерной мельницы в течение 30 секунд, затем центрифугируйте образцы при 20 000-кратной плотности в течение одной минуты при температуре 22 градуса Цельсия. После центрифугирования переложите надосадочную жидкость в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра и снова центрифугируйте надосадочную жидкость при температуре в 20 000 раз сильнее в течение одной минуты при температуре 22 градуса Цельсия. После добавления 30 микролитров реагента для лизиса инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Затем добавьте в пробирку 0,2 миллилитра связывающего буфера и 100 микрограммов на миллилитр протеиназы К, затем оставьте пробирки для инкубации в нагревателе при температуре 70 градусов Цельсия на 10 минут. Наконец, добавьте по 100 микролитров изопропанола в каждую пробирку. Затем поместите стекловолоконные фильтрующие трубки емкостью 700 микролитров в двухмиллилитровые сборные пробирки и переложите в них растворы экстракта.

После переноса центрифугируйте сборные пробирки при давлении в 20 000 раз в течение 30 секунд при температуре 22 градуса Цельсия. После центрифугирования вставьте стекловолокно фильтра в свежие пробирки для сбора и выбросьте пробирку для сбора. В каждую пробирку добавьте 0,5 миллилитра буфера для удаления ингибитора и проведите центрифугирование при 20 000-кратном течении силы тяжести в течение 30 секунд при температуре 22 градуса Цельсия.

Выбросьте сборную трубку после центрифугирования и поместите фильтрующие трубки в новые сборные трубки. Затем добавьте 0,5 миллилитра промывочного буфера в каждую пробирку и снова подвергнуть центрифугированию при 20 000-кратном течении силы тяжести в течение 30 секунд при 22 градусах Цельсия. Выбросьте сборную пробирку и замените ее свежей после центрифугирования.

Снова добавьте 0,5 миллилитра промывочного буфера в каждую пробирку и центрифугируйте при 20 000-кратном тепере силы тяжести в течение 30 секунд при 22 градусах Цельсия. Чтобы удалить остатки буфера для промывки, наконец, центрифугируйте сборные пробирки при 20 000-кратном тепере силы тяжести в течение одной минуты при 22 градусах Цельсия, выбросьте сборные пробирки и замените их свежими. После добавления 100 микролитров теплого буфера для элюирования инкубируйте пробирки на лабораторном столе при комнатной температуре в течение одной-двух минут и центрифугируйте пробирки для сбора при 20 000-кратной плотности в течение 30 секунд при температуре 22 градуса Цельсия.

Поместите пробирки с фильтром в стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 мл и повторно нанесите элюаты для еще одного раунда центрифугирования. Используйте 0,5-миллилитровые ПЦР-пробирки для запуска 50-микролитровых реакций в трех экземплярах с пятью микролитрами уже извлеченной ДНК для каждой реакции, затем запрограммируйте термоамплитрон и запустите цикл. Смешайте все три ПЦР-реакции в стерильных микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 миллилитров

Добавьте 750 микролитров связующего буфера и тщательно перемешайте, пипетируя вверх и вниз 10 раз. Добавьте 450 микролитров от общего объема смеси в вращающиеся колонки, вставленные в сборные пробирки, и начните центрифугирование при 17, 900-кратном течении силы тяжести в течение 30 секунд, затем выбросьте фильтрат и добавьте оставшиеся 450 микролитров смеси для второго раунда центрифугирования. Снова выбросьте фильтрат и добавьте 750 микролитров промывочного буфера в спиновые колонны и центрифугируйте при 17, 900-кратной гравитации в течение 30 секунд при 22 градусах Цельсия.

Наконец, выбросьте фильтрат и повторно раскрутите пустые столбцы при 17, 900-кратном течении силы тяжести в течение одной минуты при температуре 22 градуса Цельсия. После переноса спиновых колонок в 1,5-миллилитровые стерильные микроцентрифужные пробирки пипеткой накачают 45 микролитров элюирующего буфера и инкубируют пробирки на лабораторном столе при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем центрифугируйте колонны при давлении 17, 900 раз сильнее силы тяжести в течение одной минуты при температуре 22 градуса Цельсия.

Погрузите 1%-ный агарозный гель в однократный буфер TAE в камеру электрофореза, затем смешайте два микролитра пятикратного загрузочного буфера с восемью микролитрами амплифицированной ДНК. Наконец, загрузите все 10 микролитров образца в гель вместе с лестницей для анализа ДНК. Запустите гель при напряжении 75 вольт в течение примерно 90 минут.

Репрезентативный агарозный гель демонстрирует амплификацию внутренних транскрибируемых спейсерных областей геномной ДНК грибов, полученных из профессиональных проб воздуха. Полоса в крайнем левом углу представляет собой полосу маркера ДНК. Полосы справа представляют внутренние транскрибируемые области расшифровки, усиленные из различных проб профессионального воздуха с размерами от 750 до 1000 пар оснований.

Репрезентативная диаграмма Крона показывает присутствие разнообразных таксономических видов грибов в помещении. Пробоотборник биоаэрозольных циклонов NIOSH использовался в домашних условиях для сбора биоаэрозолей в течение одного часа для определения присутствующих грибковых видов. Табличные данные представляют собой индексы разнообразия и богатства видов грибов в закрытых помещениях.

Данные показывают более высокие индексы богатства Chao-1, индексы разнообразия Шеннона и коэффициенты несходства Брея-Кертиса в кондиционированных и испарительных средах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как собирать пробы воздуха в помещениях и на рабочих местах и извлекать геномную ДНК для анализа микробных популяций. При попытке пройти эту процедуру важно помнить об использовании лучших асептических методов для предотвращения микробиологического загрязнения образцов.