Хроматин распространение препаратов для анализа прогрессирования ооцитов мыши от профаза до метафазы II

Общей целью данного препарата для разброса хроматина является хронологическая визуализация динамических закономерностей локализации хроматин-связанных белков и морфологии хромосом ооцитов на протяжении оогенеза млекопитающих. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области женской репродуктивной биологии, такие как спаривание гомологичных хромосом, синапсис, репарация ДНК и мейотическая сегрегация хромосом. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет проводить четкую иммуномаркировку и визуализацию белков, связанных с хромосомами, а также оценивать плоидность ооцитов.

Оогенез подвержен ошибкам, а промах хромосом часто приводит к генетическим заболеваниям. Этот метод может быть использован для улучшения нашего понимания материнских причин анеуплоидии и бесплодия. После усыпления самки мыши через 14-19 дней после коитума сделайте V-образное отверстие в брюшной полости.

Затем удаляют материнский маточный рог. Затем отделите эмбрионы от плаценты и принесите эмбрионы в жертву путем обезглавливания. Затем переложите их в 35-миллиметровую чашку Петри, содержащую три миллилитра PBS при температуре 37 градусов по Цельсию.

Затем переместите одного щенка в отдельную миску, также загруженную теплой PBS. После усыпления плода сделайте надрез по вентральной средней линии задней половины, по передней половине ниже передних конечностей, и непосредственно над задними конечностями и хвостом. Затем вскройте брюшную полость эмбриона с помощью 3,5-дюймовых ножниц.

С помощью щипцов с тонкими наконечниками сместите или удалите печень и петли кишечника, обнажив половые железы. Теперь определите, являются ли гонады мужскими или женскими. Яичники расположены непосредственно ниже и позади почки, по направлению к задней стенке брюшинной полости.

Удалите оба яичника с помощью пары щипцов с тонким наконечником и перенесите их в небольшой контейнер, содержащий PBS, который поддерживается на уровне 37 градусов Цельсия. Приступайте быстро к сбору яичников со всех плодов. Далее в новую небольшую емкость полностью погрузите каждый отдельный набор яичников в полмиллилитра свежеприготовленного гипоэкстракционного буфера.

Дайте им поинкубироваться при температуре 25 градусов Цельсия не менее 15 минут, но не более 30 минут. Во время инкубации с помощью гидрофобной барьерной ручки PAP нарисуйте два квадрата размером 22 на 22 миллиметра на чистом предметном стекле. Подготовьте по одному предметному стеклу для каждого набора завязей.

Когда инкубация будет завершена, добавьте 50-микролитровую каплю 100 миллимолярной сахарозы на чистое предметное стекло и перенесите в каплю одну пару завязей. Теперь с помощью двух игл 27-го калибра дразните яичники и освободите содержащиеся в них клетки. С помощью щипцов удалите и выбросьте крупные кусочки яичников.

Затем тщательно пипеткой капаются раствор сахарозы для разгона высвободившихся клеток. Далее загрузите каждый квадрат на предметное стекло с 40 микролитрами 1% PFA с 0,2% Triton X-100. Распределите раствор по квадрату с помощью наконечника пипетки или покачивая предметное стекло вперед и назад.

Затем для каждой ванны раствора сахарозы с клетками загрузите две фиксирующие лужи с 20 микролитрами взвешенных клеток так, чтобы на каждой горке были клетки из одного набора яичников. Для сбора ооцитов ИМ или MII сначала подготовьте и усыпьте мышь-донора. Затем сделайте большое V-образное отверстие в брюшной полости таза и с помощью щипцов сместите кишечник, чтобы локализовать каждый маточный рог.

Найдите яичники, расположенные проксимальнее грудной клетки. Удерживайте яйцевод тонкими щипцами, а жир срежьте выше яичника с помощью ножниц для вскрытия. Все еще удерживая яйцевод, используйте тонкие щипцы, чтобы освободить яичник от бурсы, и перенесите яичники в чашку для сбора, содержащую среду, поддерживаемую при температуре 37 градусов по Цельсию.

Для сбора ооцитов стадии GV с помощью одномиллилитрового шприца с иглой 27 калибра высвобождается кумулюс-ооцитарные комплексы путем ручного прокола крупных антральных фолликулов. Чтобы собрать ооциты стадии MII, прорвите отверстие в ампуле яйцевода, чтобы освободить их, а не просто сделайте прокол. Теперь соберите ооциты с помощью стеклянной пипетки или капилляра, управляемого ртом, или используйте ручной микрометрический шприц.

Некоторые ооциты могут быть окружены кучевыми клетками, другие – нет. Для ооцитов типа ИМ готовят свежую гиалуронидазу в MEM-альфа/BSA для обнажения ооцитов окружающих кучевых клеток. Для каждого сбора ооцитов обрабатывайте их в инкубаторе 2,5 миллилитрами подготовленной гиалуронидазы в течение трех минут.

Затем перенесите ооциты ИМ в свежеприготовленную теплую среду MEM-альфа/BSA. В этом случае используйте стеклянную пипетку с приводом во рту, чтобы обеспечить усилие сдвига, необходимое для полного отделения кучевых клеток. В целом, успех этой процедуры требует мастерства в сборе ооцитов и манипуляциях с ними с помощью стеклянных пипеток или капилляров, управляемых ртом.

Дайте ооцитам восстановиться в инкубаторе. Тем временем в нагретую стеклянную пластину на девять лунок загрузите 300 микролитров теплого раствора Tyrode. Загрузите в две лунки 300 микролитров теплого MEM-альфа/BSA, а в одну лунку — 300 микролитров теплой среды Waymouth.

Чтобы удалить zona pellucida, перенесите от пяти до 10 ооцитов MI или MII-стадии в ванну с раствором Tyrode всего на 30-45 секунд, наблюдая за ними под микроскопом для вскрытия. Когда zona pellucida заметно растворится, немедленно перенесите ооциты в среду с помощью пипетки, предварительно смоченной средой MEM-alpha/BSA. Затем перенесите ооциты во вторую ванну с подогретой средой.

После второго купания перенесите ооциты в теплую среду Waymouth и дайте им восстановиться в инкубаторе в течение 30 минут. Чтобы подготовиться к распространению хроматина, с помощью ручки PAP нарисуйте прямоугольник размером 11 на 44 миллиметра на предметном стекле. Затем покройте предметное стекло тонким слоем 1% PFA с 0,2% Triton X-100 в воде, а затем покачивайте предметное стекло вперед и назад, чтобы распределить раствор.

Затем коснитесь слайда, чтобы удалить излишки. Теперь сифоньте от пяти до 10 ооцитов с минимальным количеством среды. Затем перенесите ооциты на подготовленное предметное стекло, одновременно протащив наконечник пипетки через фиксирующий раствор и опустив ооциты на предметное стекло примерно с одного сантиметра сверху.

Ооциты должны немедленно лопнуть, распыляя хроматин на предметное стекло. Теперь инкубируйте горки при комнатной температуре в закрытой увлажненной камере. Дайте им отстояться на ночь, чтобы хроматин прилип к предметному стеклу.

Описанная коллекция эмбрионального хроматина была использована для количественного анализа образования кроссинговера в ооцитах, полученных из эмбрионов C57 black/6J. Препараты профазного распространения хроматина были иммуномечены для обнаружения SYCP3, SYCP1 и MLH1 и окрашивались DAPI. Хромосомы пахитеновой стадии имели 27 очагов MLH1, распределенных по 20 полностью собранным структурам SC.

Когда препарат для распространения был неоптимальным и отдельные хромосомы были неразличимы, препарат не включали в оценку. В хороших препаратах SMC6 был обогащен в перицентромерной гетерохроматиновой области и вдоль плеч хромосомы, а очаги MLH1 были распределены вдоль СК на стадии пахитена. Количество MLH1-положительных кроссоверов от 15 хороших препаратов дикого типа составило около 24.

Метод сбора ооцитов был использован для оценки морфологии хроматина в ооцитах после мейотического возобновления. Локализация белка, а также плоидность были легко оценены, что выявило потенциальные причины ошибок сегрегации хромосом. Топоизомераза II-альфа может быть видна вдоль плеч хромосомы и перицентромерного гетерохроматина.

В ооцитах MII парные сестринские хроматиды можно было различать по морфологии хромосом и центромер. После освоения эти методы без культивирования или после него могут быть завершены в течение одного или двух часов для каждой мыши. После этой процедуры могут быть выполнены другие дополнительные методы, такие как иммуномечение ооцитов всей клетки и визуализация живых клеток для оценки гомологичных хромосом и сестринских хроматид в контексте клетки.

В совокупности описанные здесь методы распространения хроматина могут быть легко применены для оценки оогенеза млекопитающих и полового диморфизма хромосом и динамики белков во время мейоза.