Визуализация внутриклеточных SNARE людьми флуоресценции жизни изображений микроскопия

Общая цель этого эксперимента — визуализировать сложное образование белков SNARE в живых клетках. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области мембранного транспорта, такие как идентификация наборов белков SNARE, которые катализируют конкретные этапы транспортировки органеллы. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет напрямую визуализировать места ячеистых клеток, где SNARE участвуют в сложном образовании.

В этом эксперименте для трансфекции используется 900 000 клеток HeLa, разделенных между тремя пробирками Эппендорфа. Трансфектируйте клетки, как описано в текстовом протоколе, с помощью следующих конструкций. Образец номер один с конструкцией синтаксинина-4 mCitrine, образец номер два с синтаксинином-4 mCitrine и VAMP3-mCherry, и образец номер три с синтаксинином-3, слитым как с mCitrine, так и с mCherry.

Культивировали трансфицированные клетки в DMEM с высоким содержанием глюкозы, получавшие 10% FCS и 1% антибактериальный антимикотик при 37 градусах Цельсия с 5% CO2 в инкубаторе для клеточных культур в течение ночи. На следующий день аспирируйте среду и промойте клетки один раз средой для визуализации живых клеток в течение двух минут. После этого поместите клетки в свежую среду для визуализации.

Чтобы начать эту процедуру, поместите образец номер два при температуре 37 градусов Цельсия на нагретый предметный столик под конфокальный микроскоп флуоресцентной визуализации времени жизни во временной области с импульсным источником возбуждения для донорского флуорофора и получением данных с временным разрешением. Перед каждой флуоресцентной микроскопией с визуализацией времени жизни или измерением FLIM выберите клетку с видимой экспрессией меченых mCitrine и mCherry белков SNARE и запишите конфокальное изображение размером 256 на 256 пикселей с одновременным возбуждением обоих флуорофоров. Запишите изображение FLIM, нажав кнопку run FLIM, при этом изображение FLIM будет записываться с теми же размерами и пространственным разрешением, что и ранее записанное конфокальное изображение.

Запишите изображение с не менее чем 50 000 фотонов для анализа FLIM всей ячейки или не менее 400 фотонов на пиксель. Важно записывать измерения FLIM на расстоянии не менее одного микрометра от поверхности стекла, чтобы избежать отражения. Повторите визуализацию нескольких клеток в образце номер два и для клеток в образце номер один и образец номер три.

Затем поместите на предметный столик микроскопа чистую стеклянную крышку для записи функции отклика прибора или IRF. Настройте монохроматор эмиссионного детектора на длину волны возбуждения и нажмите кнопку run FLIM для записи FLIM-изображения с обратным рассеянием от стекла крышки. Фотозаписи будут преобразованы в изображения FLIM с помощью программного обеспечения PT32ICS конвертации.

Настройте программное обеспечение. Установите для вывода значение ImageJ для создания изображений FLIM. Установите размер изображения на 256 на 256 пикселей, а канал на два.

Нажмите кнопку «Конвертировать» и загрузите одну или несколько трасс фотонов. Удерживайте нажатой клавишу Control, чтобы выбрать несколько трассировок фотонов. Изображения FLIM должны быть сгенерированы в той же папке, где сохраняются следы фотонов.

Начните с открытия программного обеспечения для анализа данных, способного выполнять деконволюцию. Импортируйте текстовый файл, содержащий гистограмму для каждой трассировки фотона. Реорганизуйте таблицу таким образом, чтобы IRF находился во втором столбце таблицы, рядом со значениями времени в столбце A.Определите качество записанных следов фотонов, выбрав все столбцы.

Не анализируйте следы фотонов с высоким пиком отражения. Пример показан здесь. С помощью клавиши Control выберите все столбцы, содержащие гистограммы времени жизни с контролируемым качеством, которые будут аппроксимированы, а также IRF в столбце B, и загрузите нелинейную подгонку.

Загрузите функцию деконвитированной посадки, добавив эту функцию в программное обеспечение для анализа. Выберите файл функции подгонки. Эта функция подгоняет гистограммы времени жизни флуоресценции с моноэкспоненциальной функцией распада, деконволютированной с помощью IRF.

Выполните масштабирование подогнанных кривых по оси X. Подогнайте изгибы, нажав кнопку «Подогнать». Это преобразует аппроксимацию и сгенерирует лист отчета в массиве с таблицей, содержащей время жизни, смещения и амплитуды флуоресценции.

Он также сгенерирует технический лист с подогнанными кривыми и остатками подгонки. Показаны репрезентативные конфокальные изображения хелоклеток, экспрессирующих только синтаксин четыре mCitrine, снайтаксин четыре mCitrine с VAMP3 mCherry или тандемную конструкцию синтаксина three mCitrine mCherry. На этих сопровождающих изображениях времени жизни флуоресценции цвет указывает на среднее видимое время жизни флуоресценции.

Затем изображения были свернуты с интенсивностями флуоресценции флуорофора-донора mCitrine. Далее идут те же изображения с аппроксимацией с биэкспоненциальными функциями распада. Цвета пикселей указывают на предполагаемые доли синтаксина четыре в комплексе с VAMP3.

Функция отклика прибора была измерена с помощью обратного рассеяния на границе раздела стеклянной воды. Гистограммы времени жизни всей клетки показаны для клеток, экспрессирующих только синтаксин четыре mCitrine, коэкспрессирующих синтаксин четыре mCitrine с VAMP3 mCherry и экспрессирующих синтаксин три mCitrine тандемной конструкции mCherry. На панели E показано наложение кривых затухания панелей B, C и D. Вкладыши показывают те же графики, но с логарифмическим масштабированием оси Y.

Флуоресцентная гистограмма времени жизни, зарегистрированная слишком близко к поверхности поверхностного покрытия микроскопа, привела к большому пику отражения, изображенному желтой затененной областью. Наконец, показана гистограмма времени жизни с репрезентативной аппроксимацией и биэкспоненциальной функцией распада. После освоения этой техники ее можно выполнить за два-четыре часа, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости записи нескольких клеток, в то время как уровни экспрессии донора и перехватчика SNARES могут влиять на продолжительность жизни. После этой процедуры клетки могут быть активированы для ответа на вопросы, связанные с повторным укоренением опосредованного мембранного транспорта SNARE. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области мембранного транспорта к изучению межклеточных путей движения органелл во всех эукариотических клетках.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как записывать и анализировать данные FLIM. Не забывайте, что работа с генетически модифицированными организмами и мощными лазерами может быть чрезвычайно опасной, и при попытке этой процедуры всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как перчатки и средства защиты глаз.