Изоляция, культура и дифференцировки клеток стромы костного мозга и остеокластов прародителей от мышей

Общей целью этой процедуры является выделение и культивирование стромальных клеток костного мозга, или BMSC. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области костей и адипоцитов о клетках-предшественниках. Основное преимущество этого метода заключается в том, что BMSC могут быть изолированы относительно быстро, воспроизводимо и недорогим способом.

Визуальная демонстрация этого метода полезна, так как этапы препарирования может быть трудно объяснить только с помощью текста. Перед началом процедуры забора костной ткани добавьте 100 микролитров питательной среды стволовых клеток костного мозга в одну микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра на каждые три кости, которые будут собраны. И отрежьте конец от одного наконечника для дозатора объемом 200 микролитров на каждую микроцентрифужную пробирку, чтобы каждый наконечник мог поместиться в одну пробирку с закрытыми крышками.

Затем поместите первую 78-недельную усыпленную мышь в лежачее положение на доске для вскрытия и распылите на животное 70% этанола. С помощью щипцов создайте шатер кожи на животе, а с помощью стерильных ножниц для рассечения сделайте разрез кожи примерно в один сантиметр. Снимите кожу, чтобы обнажить нижнюю часть живота и ноги.

Разрежьте вдоль подвздошного гребня каждого бедра, чтобы отделить головки бедренной кости от таза, и сделайте разрез по средней линии таза, чтобы отделить подвздошные кости, и разрежьте ниже голеностопных суставов, чтобы удалить стопы. Затем отделите большеберцовую кость от бедренной кости, разрезав в коленном суставе. Затем используйте безворсовые салфетки, чтобы аккуратно удалить мышцу бедренной кости, голени и подвздошной кости.

Когда все кости будут собраны, поместите образцы в PBS на лед и перенесите образцы в стерильный капюшон. Используя стерильную технику, сделайте разрезы от одного до двух миллиметров на проксимальном и дистальном концах каждой кости, прежде чем поместить три кости в каждый модифицированный наконечник микропипетки в микроцентрифужных пробирках. Соберите костный мозг из костей с помощью центрифугирования, подтвердив, что костный мозг был полностью гранулирован на дно каждой микроцентрифужной пробирки в конце отжима.

Если весь костный мозг был собран, кости будут казаться белыми. Извлеките наконечники микропипеток и косточки из пробирок для сбора для надлежащей биологической безопасности. Чтобы покрыть клетки костного мозга, сначала используйте одномиллилитровый шприц, оснащенный иглой 25 калибра, чтобы медленно вернуть гранулы и разбить любые комки, а затем соберите образцы в одну коническую трубку объемом 15 миллилитров

Добавьте 10 миллилитров питательной среды для стволовых клеток костного мозга на 500 микролитров образца и отфильтруйте клеточную суспензию через фильтр 70 микрон в 50-миллилитровую коническую пробирку для удаления любых костных фрагментов. После подсчета высейте клетки костного мозга в соотношении от 10 до 6 клеток на квадратный сантиметр в свежую питательную среду для 72-часовой инкубации при 37 градусах Цельсия и 5% CO2. На третий день замените надосадочную жидкость свежей средой, после чего меняйте среду каждые два дня до тех пор, пока клетки не достигнут 80-100% конфлюенции.

Чтобы расщепить культуру популяции клеток костного мозга, поместите собранные клетки костного мозга одной мыши в 10-сантиметровую чашку для клеточной культуры на 48 часов в свежей питательной среде в инкубаторе для клеточных культур. На второй день культивирования удалите неадгезивный супернатант, содержащий гемопоэтические стволовые клетки, и тщательно промойте планшет PBS, не нарушая адгезивные клетки костного мозга. Замените PBS на 0,25% трипсина.

Через одну-три минуты при 37 градусах Цельсия погасите реакцию свежей питательной средой для клеток и подсчитайте клетки в полученной клеточной суспензии. Центрифугируйте соответствующее количество клеток для нанесения покрытий и повторно суспендируйте гранулу в свежей питательной среде, достаточной для достижения желаемой плотности покрытия. Затем поместите планшеты в инкубатор для клеточных культур до полного слияния.

Чтобы индуцировать дифференцировку остеобластов стволовых клеток костного мозга, заменяйте среду для культивирования клеток средой для дифференцировки каждые два дня до тех пор, пока клетки не начнут продуцировать белые узелки минерализации, которые можно наблюдать макроскопически. Чтобы индуцировать дифференцировку адипоцитов стволовых клеток костного мозга, замените среду для культивирования клеток костного мозга конфлюентной культуры клеток костного мозга средой для индукции адипоцитов. После двух дней культивирования замените надосадочную жидкость свежей средой для индукции адипоцитов, а на четвертый день переключитесь на базовую среду для адипоцитов.

На седьмой день подтвердите, что клетки накопили липидные капли и что они демонстрируют фенотип, похожий на фенотип зрелых адипоцитов. Для дифференцировки гемопоэтических стволовых клеток в остеокласты, когда культура тотальных клеток костного мозга или неадгезивная клеточная культура становится адгезивной, среду для культивирования клеток заменяют средой для дифференцировки остеокластов. Меняйте среду каждые два дня и ежедневно проверяйте дифференцировку остеокластов под световым микроскопом при 10-кратном увеличении до тех пор, пока остеокласты не сольются и не сформируют многоядерные клетки, обычно на 5-7 день дифференцировки.

Сливающиеся культуры BMSC могут быть дифференцированы в остеобласты с использованием остеогенной среды, состоящей из аскорбиновой кислоты и бета-глицерофосфата. После нескольких дней дифференцировки остеобласты начинают экспрессировать щелочную фосфатазу. И дальнейшая дифференцировка приведет к образованию остеоидного матрикса и, в конечном итоге, к минерализации этого матрикса.

Интересно, что только часть клеток дифференцируется в остеобласты in vitro, что выявляется при окрашивании кристаллами фиолетового цвета. Независимо от того, используются ли смешанные популяции или популяции клеток расщепленного костного мозга, только часть клеток дифференцируется в адипоциты, которые выглядят как круглые клетки с несколькими липидными вакуолями, которые могут быть окрашены масляным красным O-красителем. Культуры стволовых клеток человека с добавлением фактора стимуляции мышиных клеток и RANKL быстро сливаются с образованием многоядерных клеток, которые окрашиваются положительно на TRAP.

Эти остеокласты способны резорбировать минеральный матрикс in vitro и могут быть использованы для оценки остеокластической активности. После освоения эта техника может быть выполнена менее чем за час, если она выполнена правильно, в зависимости от количества мышей. Выполняя эту процедуру, важно помнить о необходимости стерилизации инструментов и предварительной подготовки среды, чтобы иметь возможность работать как можно быстрее и асептически.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как выделять и культивировать стромальные клетки костного мозга.