Синтез функционализированных 10-Нм полимерным покрытием частиц золота для ориентации эндотелия и доставки лекарств

Общая цель этой процедуры заключается в синтезе функционализированных золотых наносфер с полимерным покрытием, которые имеют диаметр 10 нанометров, биосовместимы, имеют увеличенное время циркуляции и могут быть визуализированы с помощью флуоресцентной микроскопии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы кардиологии о проницаемости эндотелия при заболеваниях. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет создавать биосовместимые сверхмелкие частицы, которые имеют функциональные группы, доступные для дальнейшей кастомизации.

Во-первых, в микроцентрифужной пробирке разбавьте 12 микролитров 80% ТГФК одним миллилитром ультрачистой воды. Зажмите колбу с круглым дном объемом 100 миллилитров над магнитной пластиной для перемешивания. Добавьте в колбу 45 миллилитров воды и небольшой брусок в форме яйца.

Начните помешивать воду со скоростью 300 об/мин. Добавьте в колбу 0,5 миллилитра одного молярного раствора гидроксида натрия, и один миллилитр разбавленного раствора ТГПК. Продолжайте энергично помешивать реакционную смесь в течение пяти минут.

Затем добавьте два миллилитра 25 миллимолярного раствора хлорауриновой кислоты в реакционную смесь, помешивая. Убедитесь, что желтая реакционная смесь становится темно-коричневой в течение нескольких секунд, что указывает на образование отрицательно заряженных наночастиц золота, покрытых THPC. Продолжайте помешивать смесь в течение 15 минут.

Пока смесь перемешивается, приготовьте водный раствор гетеробифункционального амина ПЭГ тиола, карбоксиметил ПЭГ тиола и монофункционального метокси ПЭГ тиола. После того, как реакционная смесь с наночастицами золота перемешается в течение 15 минут, уменьшите скорость перемешивания до 100 об/мин. Добавляйте растворы ПЭГ по каплям в смесь во время помешивания.

Продолжайте осторожно помешивать смесь в течение ночи при комнатной температуре. Затем закройте один конец целлюлозной мембраны MWCO мощностью 12-14 килодальтон диализным зажимом. С помощью пипетки перенесите реакционную смесь на мембрану.

Закройте другой конец мембраны вторым диализным зажимом. Диализуйте смесь наночастиц против четырех литров воды, перемешиваемой при 60 об/мин, в течение 72 часов. Меняйте воду каждые два часа в течение первых шести часов, а затем каждые шесть-12 часов.

Затем отфильтруйте полуочищенную смесь пегилированных наночастиц золота через шприцевой фильтр 0,2 микрометра в коническую пробирку объемом 50 миллилитров. Заморозьте очищенный раствор наночастиц при температуре минус 80 градусов Цельсия примерно на пять часов. Лиофилизация очищенных наночастиц с помощью сублимационной сушилки.

Чтобы начать приготовление флуоресцентных пегилированных наночастиц золота, зажмите колбу с круглым дном объемом 100 миллилитров над магнитной пластиной для перемешивания. Добавьте в колбу 18 миллилитров ультрачистой воды и небольшой батончик для перемешивания в форме яйца и начните помешивать при 100 оборотах в минуту. В четырехмиллилитровой конической трубке соедините два миллиграмма лиофилизированных пегилированных наночастиц золота с двумя миллилитрами воды.

Затем переложите раствор наночастиц в колбу с круглым дном для дальнейшего восстановления. Добавьте один миллилитр молярного карбонатного буфера pH 8,8, 0,1 к восстановленным наночастицам во время перемешивания. Затем добавьте пять микролитров из 10 мг на миллилитр раствора флуоресцентного эфира ангидроксисукцинимида в диметилсульфоксиде.

Заверните колбу в фольгу, чтобы полностью исключить попадание света. Продолжайте перемешивать смесь флуоресцентных наночастиц в течение ночи при комнатной температуре. Затем диализуйте смесь против четырех литров воды в течение 72 часов, используя процедуру, описанную в разделе Приготовление пегилированных наночастиц золота.

Держите контейнер накрытым пленкой на протяжении всего диализа. Отложите один миллилитр очищенных флуоресцентных пегилированных наночастиц для характеризации. Заморозьте, лиофилизируйте и храните оставшиеся флуоресцентные наночастицы при температуре четыре градуса Цельсия.

Чтобы визуализировать ядро наночастиц золота с помощью просвечивающей электронной микроскопии, сначала поместите 10 микролитров очищенного раствора флуоресцентных наночастиц на сетку ПЭМ с углеродным покрытием. Оставьте каплю на пять минут. Затем используйте фильтровальную бумагу, чтобы тщательно отводить лишнюю жидкость от края сетки ПЭМ, пока на сетке не останется только пленка флуоресцентных наночастиц.

Изображение наночастиц при напряжении 80 киловольт с увеличением от 50 000 до 150 000. Чтобы измерить размер гидродинамических наночастиц, поместите один миллиграмм лиофилизированных наночастиц золота, покрытых THPC, в микроцентрифужную пробирку. Добавьте по одному миллилитру воды в каждую трубку, и перелейте растворы в один миллилитр прозрачных пластиковых кювет.

Оцените каждое решение с помощью динамического рассеяния света и измерьте сферические гидродинамические диаметры частиц. Затем перенесите кювету, содержащую флуоресцентные пегилированные наночастицы золота, в спектрофлуориметр. Установите длину волны экзоции равной 633 нанометрам и считайте сигналы излучения в диапазоне от 650 до 800 нанометров.

Затем, чтобы оценить биосовместимость при концентрациях 7 наночастиц, сначала ввели 100 микролитров суспензии эндотелиальных клеток жировой подушки крысы в DMEM в каждую из 21 лунок 96-луночного планшета, обработанного стерильной культурой тканей. Инкубируйте клетки до тех пор, пока не будет достигнута конфлюенция, затем получите семь растворов флуоресцентных наночастиц в DMEM с концентрацией от нуля до 1000 микрограммов на миллилитр. Отсасывайте DMEM из лунок.

Поместите по 100 микролитров каждого из семи растворов наночастиц в каждую из отдельных лунок в трех количествах. Дайте клеткам и наночастицам совместно инкубироваться в течение 16 часов. Затем отсасывайте DMEM и взвешенные или слабо прикрепленные наночастицы из лунок.

Добавьте в каждую лунку по 100 микролитров свежего DMEM, содержащего 20 микролитров раствора MTS/PES. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение двух часов. Затем оцените жизнеспособность клеток с помощью хлорометрического анализа на 492 нанометрах с помощью планшетного ридера.

Затем засейте эндотелиальные клетки крысиного жира на стерильную стеклянную крышку объемом 12 миллилитров с соотношением 10 000 клеток на квадратный сантиметр. Кормите клетки DMEM с добавлением 10% FBS и 1% пенициллина стрептомицина. Инкубируйте клетки до тех пор, пока не будет достигнуто полное слияние.

При желании модифицируйте эндотелиальный гликокаликс, затем инкубируйте клетки с 550 микрограммами на миллилитр флуоресцентных наночастиц золота в течение 16 часов. Подготовьте клетки к иммунофлуоресцентной микроскопии. Закрепите каждое защитное стекло на предметном стекле микроскопа с монтажной средой, предотвращающей выцветание, содержащей DAPI.

Заклейте края чехла лаком для ногтей. Визуализируйте иммуноокрашенные эндотелиальные клетки с помощью конфокальной микроскопии. Визуализируйте ядра, гликокаликс сульфата гепарина и наночастицы с синим, зеленым и дальним красным каналами соответственно.

ПЭМ наночастиц золота с покрытием THPC, показал диаметр частиц от двух до трех нанометров. ПЭМ пегильтированных наночастиц смог подтвердить только наличие дисперсных частиц, так как ПЭГ не виден на изображениях ПЭМ. DLS наночастиц с покрытием и пегилированием THPC показал сдвиг пикового диаметра частиц с 2,5 нанометров до 10,5 нанометров.

Флуоресцентное излучение имело максимум между 660 и 672 нанометрами при возбуждении светом 633 нанометра, что соответствовало ожидаемому максимальному излучению на 665 нанометров для используемого флуоресцентного зонда. Эндотелиальные клетки жировых отложений крыс показали аналогичные уровни жизнеспособности после 16 часов совместной инкубации с флуоресцентными пеголизированными наночастицами золота в концентрациях до одного миллиграмма на миллилитр, что указывает на отсутствие значительной токсичности от наночастиц. Минимальное поглощение наночастиц наблюдалось в эндотелиальных клетках жировых отложений крыс со здоровыми гликокаликсами.

Значительно большее поглощение происходило в клетках с деградированными гликокаликсами, о чем свидетельствует увеличение красных флуоресцентных сигналов от наночастиц. После этой процедуры можно провести дальнейшую модификацию, такую как конъюгация с открытыми функциональными группами, чтобы модифицировать частицы для специфического нацеливания на компонент эндотелия или доставки лекарственного средства.