Блот Assay количественных Dot для AAV титрования и его использования для функциональной оценки аденоассоциированный вирус Ассамблеи-активации белков

Этот метод позволяет определить как очищенные, так и неочищенные вакуумные титры AV и оценить способность AAV AAP способствовать сборке родственных и гетерологичных серотипов AV. Основное преимущество этого метода заключается в том, что это простой и недорогой метод, который позволяет избежать недостатков других методов титрования AAV. Хотя этот метод обычно используется для количественного определения векторов AAV, он также может быть применен для решения различных фундаментальных вопросов биологии AAV, как показано в этом протоколе.

В нулевой день, после культивирования клеток HEK 293 до 90% конфлюенции, приготовьте реагент для трансфекции, смешав плазмиды в 96 микролитрах PBS без кальция или магния в стерильных микроцентрифужных пробирках объемом 1,5 миллилитров. Как указано в этой таблице, общее количество ДНК составляет два микрограмма на лунку. Добавьте четыре микролитра раствора PEI в смесь плазмидной ДНК PBS.

Конечный объем составляет примерно 100 микролитров или 5% объема питательной среды. Кратковременно пробурьте пробирки и инкубируйте смесь DNA PEI при комнатной температуре в течение 15 минут. После инкубации кратковременно прокрутите пробирки в микроцентрифуге, чтобы собрать жидкость на дно.

И добавьте смесь ДНК PEI по каплям в питательную среду в каждой лунке культурального планшета HEK 293. Затем осторожно перемешайте планшеты и верните их в инкубатор с температурой 37 градусов Цельсия с 5% CO2. Трансфекция клеток HEK 293 является критически важным компонентом этого протокола для производства вируса с высоким титром.

Следует использовать здоровые клетки с низким числом пассажей и следить за тем, чтобы не нарушить монослой клеток. В первый и второй дни под инвертированным флуоресцентным микроскопом наблюдайте за клетками, трансфицированными плазмидой PCMVGFP, чтобы оценить эффективность трансфекции. На пятый день пипетируйте клетки и вируссодержащую среду вверх и вниз или используйте скребок для клеток, чтобы соскоблить все клетки.

Затем переложите суспензию в полипропиленовые конические трубки объемом 15 миллилитров. Храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия до использования. Чтобы восстановить вирусные частицы, быстро разморозьте замороженные пробирки на водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия.

Затем энергично вращайте трубки в течение одной минуты, чтобы максимизировать восстановление AAV из клеток. Гранулируйте клеточный мусор центрифугированием при температуре 3,700 G и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Затем перелейте по 200 микролитров надосадочной жидкости из каждой пробирки в пробирки с маркированными микроцентрифугами с завинчивающимися крышками для анализа методом дот-блот

Для обработки образцов эндонуклеазой Serratia marcescens готовят смесь реагентов А и смесь В. Добавьте по 10 микролитров каждого реагента в каждую пробирку с образцом. Сделайте образцы вихревыми в течение пяти секунд и кратковременно вращайте их, чтобы собрать жидкость на дно пробирок.

Затем инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия не менее одного часа. После краткого вращения образцов проводят обработку протеиназой К, приготовив смесь С реактива и добавив по 180 микролитров в каждую пробирку. Затем после вортекса и кратковременного вращения трубок снова инкубируйте их при температуре 55 градусов Цельсия в течение одного часа.

Как только образцы вернутся к комнатной температуре, добавьте 200 микролитров фенолхлороформа и перебейте пробирки на одну минуту. Затем открутите образцы в микроцентрифуге при температуре 16, 100 G и комнатной температуре в течение не менее пяти минут. Перенесите 320 микролитров водного слоя или 80% объема водной жидкости в новую стандартную микроцентрифужную пробирку.

Этот этап переноса имеет решающее значение, так как для поддержания точности количественного определения AAV из образца должен быть взят один и тот же объем. Следует соблюдать осторожность, чтобы избежать органической фазы при удалении водного слоя. Приготовьте реактив Mix D и добавьте 833 микролитра в каждую пробирку с образцом.

После вортекса пробирки инкубируйте их при температуре минус 80 градусов Цельсия не менее 20 минут. После центрифугирования слейте надосадочную жидкость и промокните пробирки один раз на чистом бумажном полотенце. Нанесите пипеткой примерно 500 микролитров 70%-ного этанола в каждую пробирку и поворачивайте пробирки в течение пяти секунд.

После повторного вращения образцов слейте надосадочную жидкость и промокните пробирки один раз на чистом бумажном полотенце. Затем высушите гранулы при температуре 65 градусов Цельсия перед тем, как снова суспендировать их в TE-буфере. Для проведения анализа методом дот-блоттинга необходимо подготовить стандарты плазмидной ДНК путем разбавления векторной геномной плазмидной ДНК AAV до 10 нанограммов на микролитр в воде или буфере Tris-HCL.

Перенесите 25 микролитров разбавленной плазмидной ДНК в свежую пробирку и линеаризируйте ее соответствующим ферментом рестрикции в реакционном объеме 50 микролитров в течение одного часа. Добавьте 450 микролитров воды или TE в пробирку, содержащую стандарт расщепленной плазмиды ДНК, и тщательно перемешайте. Затем перелейте 70 микролитров этой смеси в новую микроцентрифугу объемом 1,5 миллилитра с 1,330 микролитрами воды или TE, чтобы получить стандарт разбавленной плазмиды.

Чтобы настроить аппарат для блот-блоттинга, с помощью ножниц разрежьте промокательную мембрану до размера, соответствующего количеству проб и стандартам. Смочите мембрану водой на 10 минут перед тем, как поместить ее на аппарат для блот-блота. Затем закройте неиспользуемые лунки.

Добавьте воду в колодцы, в которые будут загружаться пробы. Примените вакуум, протяните воду через лунки, проверьте на наличие ошибок, а затем снова закрутите винты. При необходимости повторите тест.

Нанесите по 400 микролитров каждого стандарта разведенной плазмидной ДНК в каждую лунку и запустите четыре полосы стандартных разведений. Используйте две отдельные аликвоты стандартного дайджеста и загрузите каждую в двух экземплярах. Затем внесите 200 микролитров на лунку каждого образца вирусной ДНК.

Примените легкий вакуум, чтобы протянуть растворы ДНК через лунки. Затем, когда все лунки опустошатся, выпустите вакуум, отрегулировав трехходовой клапан. Добавьте в каждую лунку по 400 микролитров одного щелочного раствора.

Затем подождите пять минут, прежде чем снова применять вакуум, чтобы опорожнить лунки. Снова нанесите пылесос и разберите аппарат для блот-блота. Затем снимите мембрану и промойте ее двумя X SSC.

Поместите мембрану на чистое бумажное полотенце стороной, связанной с ДНК, вверх, чтобы удалить избыток буфера. Используйте подходящий УФ-сшивающий агент для УФ-сшивания блотированной ДНК с мембраной. Теперь мембрана готова к гибридизации.

Поместите мембрану в бутылку для гибридизации стороной вверх, связанной с ДНК. Промойте мембрану пятью-10 миллилитрами предварительно подогретого буфера для гибридизации и выбросьте буфер. Затем добавьте 10 миллилитров предварительно подогретого буфера для гибридизации и поместите бутылку во вращающуюся гибридизационную печь, установленную на 65 градусов Цельсия.

Вращайте бутылку не менее пяти минут. Быстро добавьте денатурированную ДНК сперматозоида и радиоактивный зонд в буфер для гибридизации в бутылке и встряхните его в течение 10 секунд для смешивания. Верните бутылку в духовку с температурой 65 градусов Цельсия и инкубируйте ее при вращении при температуре 65 градусов Цельсия не менее четырех часов.

Как только гибридизация будет завершена, остановите вращение. Извлеките бутылочку для гибридизации, а затем налейте раствор радиоактивного зонда в коническую трубку объемом 50 миллилитров с герметичной заглушкой. Чтобы промыть мембрану, добавьте от 20 до 30 микролитров предварительно подогретого буфера для промывки в бутылку для гибридизации и вращайте ее в течение пяти минут.

Повторите эту стирку еще два раза. После третьей промывки снимите мембрану с флакона для гибридизации, а с помощью бумажных полотенец удалите излишки буфера с мембраны. Затем поместите мембрану в прозрачный пластиковый держатель для бумаги.

С помощью счетчика Гейгера проверьте радиоактивные сигналы на мембране. После воздействия стертого люминофорного экрана на мембрану отсканируйте экран с помощью сканирующей системы люминофорного изображения и получите данные об интенсивности сигнала каждой точки. Проводите анализ данных в соответствии с текстовым протоколом.

Этот количественный точечный блот для титрования вектора AAV 2G9 имеет два набора стандартов и три различных количества векторной подготовки AAV, включая 0,3, 0,1 и 0,03 микролитра в двух экземплярах. Количества, подлежащие анализу на блоттинге, определяются опытным путем или на основании предварительного анализа. Методом интерполяции было определено, что аликвоты 0,3, 0,1 и 0,03 микролитра вектора AAV 2G9 имели в среднем титр 5,16,0,27 нанограмма эквивалента микролитров.

Все возможные родственные и гетерологичные серотипные комбинации белков VP3 cas-pid и AAP из AAV5, AAV9 и змеиного AAV оценивали на предмет сборки капсида с помощью количественного анализа точечного блоттинга. Результаты этого графика показывают, что AAV5 VP3 собирается независимо от того, был ли AAP предоставлен в трансляции. Кроме того, AAP5 и AAP9 могут способствовать сборке капсида AAV9 VP3, хотя AAP5 функционирует менее эффективно, чем AAP9.

Ни AAP5, ни AAP9 не проявляют активности, стимулирующей сборку на змейке AAV VP3, а змейка AAP только способствует сборке змейки AAV VP3. Для оценки нуклеазной активности трех коммерчески доступных нуклеаз в неоптимизированных условиях, содержащих примеси, полученные из клеточных и культуральных сред, был применен дот-блоттинг. Фермент А был обнаружен не таким активным, как два других фермента, что свидетельствует о том, что выбор нуклеазы может существенно повлиять на считывание результатов анализа дот-блоттинга.

Этот метод прост для количественного определения векторов AAV и играет важную роль в оценке роли AAP в стимулировании сборки капсидов AAV, полученных из родственных и гетерологичных серотипов. После освоения эта техника может быть выполнена за один день, если она выполнена должным образом после получения образцов анализа в экспериментах на клеточных культурах. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о тщательном пипетировании правильного объема жидкости, чтобы обеспечить количественную точность.

После его разработки, применение количественного анализа точечного блоттинга для изучения AAP проложило путь исследователям в области биологии AAV к дальнейшему пониманию механизма сборки капсида AAV. Пожалуйста, не забывайте, что работа с клетками человека, вирусными агентами, фенол-хлороформом и радиоактивными материалами может быть чрезвычайно опасной. А использование лабораторных халатов, перчаток и защитных очков необходимо для ограничения воздействия.

С этими материалами следует работать только в разрешенных местах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как подготовить образцы дот-блоттинга для количественного определения AAV, настроить аппарат для дот-блоттинга, определить титр AAV и применить эту процедуру к изучению биологии AAV. После этой процедуры могут быть проведены другие анализы, такие как анализ векторной трансдукции AAV в культуральных клетках, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как функциональный титр векторизованных по сравнению с титром физических частиц, определенным с помощью анализа точечного блоттинга.