Долгосрочные последствия поведенческих и репродуктивного эмбриональных воздействия низких доз ядовитых веществ

Общая цель этих процедур заключается в исследовании долгосрочных эффектов воздействия низких доз BPA на ранних этапах эмбриогенеза. Эмбрионы C.elegans подвергаются воздействию BPA в течение ограниченного периода времени и проверяются по достижении зрелого возраста на фертильность и обучаемость. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, касающиеся долгосрочных последствий воздействия токсикантов, таких как бисфенолы и другие соединения, разрушающие эндокринную систему.

Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет тестировать долгосрочные и малозаметные эффекты токсикантов на развитие с помощью количественных поведенческих анализов на простой в использовании лабораторной модели беспозвоночных. Применение этого метода распространяется на понимание развития и нейронной основы вредных последствий для здоровья от воздействия токсикантов даже в низких дозах. Идея этих экспериментов пришла нам в голову, когда мы поняли, что ряд сложных или многофакторных расстройств, по-видимому, имеют тот или иной компонент развития.

Что может оказывать свое влияние, в частности, через аномальную экспрессию критических генов. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, поскольку шаги приучения к внутреннему прикосновению могут быть трудными для изучения исключительно с помощью текстовых инструкций. За день до синхронизации перенесите червячки N2 на 100-миллиметровые пластины, содержащие среду NGM, намазанную E.coli OP50.

Путем откалывания плиты площадью примерно один сантиметр квадратный. Дайте червям расти в течение трех дней при температуре 20 градусов по Цельсию. Через три дня, когда планшеты будут заполнены хорошо откормленными, зрелыми взрослыми особями, содержащими видимые эмбрионы, начните синхронизацию, сначала промыв каждую пластину пятью миллиметрами буфера M9 и перенеся жидкость в стерильную коническую центрифужную пробирку объемом 15 миллилитров.

Центрифугируйте при 3 000-кратном течении силы тяжести в течение четырех минут при комнатной температуре. После цертрифугации с помощью десятимиллилитровой пипетки осторожно удалите надосадочную жидкость из каждой рыхлой гранулы взрослых червей. Затем добавьте в каждую гранулу от червей по 5 миллилитров свежеприготовленного раствора гипохлорита, и аккуратно перемешайте.

Центрифугируйте при 3 000-кратном тепере силы тяжести при комнатной температуре в течение четырех минут. Критически важно получить синхронизированные популяции. Приготовление свежего раствора гипохлорита помогает избежать загрязнения и несинхронизации животных.

Далее с помощью десятимиллилитровой пипетки удалите надосадочную жидкость, а семь миллилитров промойте буфер М9. Повторите этот шаг дважды. После последней промывки добавьте к яйцам примерно 100 микролитров буфера M9.

Затем переложите около 50 микролитров яиц в две миллилитровые микропробирки, содержащие BPA, разведенные в S-буфере. Отрегулируйте количество S-буфера, чтобы обеспечить правильную конечную концентрацию BPA в пробирке, как показано в таблице. Поместите трубки на качающийся или вращающийся встряхиватель, движущийся со скоростью 25 наклонов в минуту, или 25 оборотов в минуту в течение четырех часов при температуре 20 градусов Цельсия.

Через четыре часа поместите трубки в держатели трубок и дайте червям осесть. Выбросьте надосадочную жидкость и перенесите червей в планшеты NGM, засеянные OP50 E.coli. Дайте червям расти в течение 60 часов при температуре 20 градусов Цельсия.

Осматривайте пластины каждый день на предмет загрязнения. Загрязненные пластины NGM обычно обесцвечиваются и сопровождаются отдельными колониями. Проверьте червей под микроскопом на предмет скученности.

Во-первых, используйте стерилизованный огнем медиатор из платиновой проволоки 30-го калибра, чтобы перенести примерно десять синхронизированных молодых червей на новые незасеянные пластины NGM. Оставьте червей в покое на пять минут, чтобы дать им время акклиматизироваться к новой пластине. Затем простерилизуйте волосок бровей, прикрепленный к концу деревянной шпажки или зубочистки, обмакнув в 70% этанол.

Протрите чистой безворсовой салфеткой и подождите одну минуту, пока этанол испарится. Аккуратно прикоснитесь к червячку на голове, используя волосы бровей. Повторяйте прикосновения, оставляя десять секунд между прикосновениями, чтобы червь мог восстановиться.

Продолжайте трогать, оставляйте десятисекундные интервалы между стимулами, пока червь не перестанет двигаться назад. Запишите количество прикосновений, необходимых для возникновения этого привыкания. Важно предусмотреть десятисекундный интервал между прикосновениями, так как это дает животному время на восстановление и помогает получить последовательные анализы поведения привыкания.

Взрослые животные, которые эмбрионно подвергались воздействию одного микромоляра или более высокой концентрации BPA, откладывали значительно меньше яиц по сравнению с контролем, представленным горизонтальной линией. Взрослые животные, полученные из эмбрионов, которые подвергались воздействию концентраций BPA до 0,1 микромоля, демонстрируют неассоциативный дефицит, основанный на увеличенном количестве передних контактов, необходимых для их привыкания. При подготовке эмбрионов к воздействию бисфенола А важно выбрать планшет с хорошо откормленными взрослыми особями C.elegans со зрелыми яйцеклетками, видимыми под микроскопом вскрытия, чтобы иметь достаточный размер образца.

Этот метод прокладывает путь исследователям в области экологической токсикологии для оценки влияния токсинов и других соединений, разрушающих эндокринную систему, на поведение и разработки механистических экспериментов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как подвергать эмбрионы C.elegans воздействию BPA на ранних стадиях и как проверить поведение привыкания у взрослых особей, полученных от эмбрионов, подвергшихся воздействию BPA.