Усовершенствованный метод для коллекции спинномозговой жидкости от наркотизированных мышей

Общая цель этой процедуры заключается в улучшении сбора спинномозговой жидкости у мышей без загрязнения кровью. Этот метод обеспечивает простой и надежный способ сбора ликвора для мониторинга биомаркеров нервных заболеваний. Основное преимущество этого метода заключается в том, что добавление микроманипулятора для помощи в сборе спинномозговой жидкости у мышей снижает загрязнение крови во время сбора.

Начните с помещения вытянутого стеклянного капилляра в капилляродержатель, который прочно закреплен на микроманипуляторе. Далее, рассматривая через препарирующий микроскоп, с помощью прямых щипцов сломайте кончик заостренного капилляра так, чтобы внутренний диаметр отломанного кончика составлял примерно от 10 до 20 микрон. Затем прикрепите тонкую трубку и шприц к другому концу капилляродержателя, соедините тонкую трубку и шприц трехходовым клапаном и сдвиньте трехходовой клапан в открытое положение.

Затем погрузите шприц, чтобы удалить любые загрязнения и создать положительное давление в капиллярной трубке. Повторите это несколько раз, отсоединив и снова подсоединив шприц к трехходовому клапану. Затем наберите воздуха до 100-200 микролитров перед окончательным подсоединением шприца с трехходовым клапаном.

Переместите микроманипулятор со стеклянным капилляром в сторону, чтобы предотвратить повреждение во время хирургической процедуры. Перед началом операции убедитесь, что мышь полностью обезболилась, зажав все четыре конечности и наблюдая за отсутствием реакции. Затем с помощью препарирующих ножниц подстригите и подстригите шерсть на затылке мыши, сверху от глаз между ушами до нижней части шеи.

Закрепите головку мыши с помощью адаптера для мыши со стереотаксической рамкой. Убедитесь, что головка не может двигаться и плотно закреплена в адаптере, аккуратно надавливая на головку мыши. С помощью ножниц и изогнутых щипцов разрежьте кожу мыши на задней части шеи, а затем вниз по середине черепа между ушами и глазами мыши.

Раздвиньте кожу и ткани и выведите их из области над цистерной. Рассматривая через препарирующий микроскоп, осторожно рассеките последние тонкие слои мышц над основанием черепа с помощью щипцов и переместите эти слои мышц в сторону и за пределы интересующей области. Как только твердая мозговая оболочка над большой цистерной обнажится, используйте влажную ватную палочку, чтобы протереть мембрану, а затем используйте сухую ватную палочку, чтобы высушить область.

Большая цистерна имеет треугольную форму с одним-двумя крупными кровеносными сосудами, проходящими через эту область. Любая сторона кровеносных сосудов или между ними является оптимальной для введения капилляров и сбора ликвора. После того, как цистерна магна обнажена, используйте микроманипулятор, чтобы выровнять стеклянный капилляр по задней части головы мыши так, чтобы заостренная точка находилась сразу за мембраной под углом от 30 до 45 градусов.

Затем опустите шприц один или несколько раз, а затем переместите поршень назад на 100-200 микролитров, чтобы убедиться в отсутствии загрязнений и отрицательном давлении в стеклянном капилляре. Затем переместите кончик капилляра ближе к мембране до тех пор, пока не будет видно сопротивления, но без прокола мембраны. Постучайте по элементам управления микроманипулятором, чтобы аккуратно постучать по капиллярной трубке через мембрану.

Спинномозговая жидкость должна автоматически втягиваться в капиллярную трубку после прокола отверстия. Оставьте капилляр на месте, чтобы медленно собирать спинномозговую жидкость. Если ликвор перестал течь, медленно наберите в шприц примерно 50 микролитров, чтобы создать большее отрицательное давление в капилляре.

От десяти до 15 микролитров спинномозговой жидкости собирается за 10-30 минут. После того, как желаемый объем спинномозговой жидкости будет собран, закройте трубку, сдвинув трехходовой клапан для закрытия, и снимите шприц, подключенный к трубке. Откройте и закройте трубку, чтобы создать выравниваемое давление в капилляре, трубке и области за пределами капилляра.

Затем снова подсоедините шприц перед аккуратным удалением стеклянного капилляра из мыши с помощью микроманипулятора. Далее поместите пробирку для сбора, содержащую один микролитр ингибитора протеазы 20X, под заостренное острие стеклянного капилляра. Откройте трубку и аккуратно погрузите шприц.

Спинномозговая жидкость должна вытекать из капилляра и попадать в сборную трубку. После сбора импульсное центрифугирование спинномозговой жидкости смешайте образец с ингибитором протеазы на дне пробирки для сбора. Образцы спинномозговой жидкости могут быть аликвотированы, а затем сохранены для дальнейшего анализа при температуре минус 80 градусов Цельсия.

Ликвор, собранный у мышей APP/PS1, продемонстрировал значительное повышение уровня A beta 42 у человека в возрасте 12 месяцев. У мышей дикого типа человеческий A beta 42 не был обнаружен. После освоения эта процедура может быть выполнена за один час при правильном выполнении.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о том, что при введении капилляра следует избегать кровеносных сосудов и вносить лишь незначительные коррективы с помощью микроманипулятора во время сбора ликвора, чтобы избежать загрязнения кровью.