Двух Фотон кальция изображений в нейрональных дендритов в срезах головного мозга

Мы представляем метод, объединяющий поклеточного фиксации записи и два Фотон изображений для записи Ca^{2 +} переходные процессы в нейрональных дендритов в острой мозга ломтиками.

Общая цель этого эксперимента заключается в изучении повышения уровня кальция в дендритах нейронов в ответ на различные парадигмы стимуляции с использованием записей целых клеток в нейрональных сомах параллельно с двухфотонной визуализацией кальция в дендритах. Этот метод может быть использован для мониторинга передачи сигналов кальция в небольших дендритных компартментах, что позволяет внимательно наблюдать за процессами, происходящими в дендритных ветвях во время интеграции синаптических входов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет наблюдать паттерны кальциевой сигнализации с высоким пространственно-временным разрешением и специфичностью.

Поместите мозг мыши на чашку Петри, содержащую постоянно насыщенную кислородом холодную сахарозу ACSF. Чтобы приготовить срезы гиппокампа из извлеченного мозга, дайте мозгу остыть в течение примерно двух минут. После этого положите лист фильтровальной бумаги на упакованную льдом чашку Петри и перенесите мозг на фильтровальную бумагу.

Затем рассеките мозг на два полушария. Приклейте рассеченные полусферы к вибратомной секционной платформе и погрузите ее в лоток для секционирования, наполненный ледяной оксигенированной сахарозой ACSF. Затем нарежьте ломтики толщиной 300 микрометров под углом один градус Цельсия с помощью вибратомного охладителя или поместите лед вокруг вибратомного лотка.

С помощью малярной кисти перенесите срезы, содержащие гиппокамп, в ванну с кислородонасыщенным ACSF-восстановлением, нагретую до 37 градусов Цельсия. На этом этапе перенесите срез гиппокампа в ванну под объективом лазерного сканирующего двухфотонного микроскопа. Непрерывно проделывайте ванну с кислородосодержащим ACSF-normal.

Затем используйте инфракрасную дифференциально-интерференционно-контрастную микроскопию, чтобы определить местоположение интересующей клетки по ее размеру, форме и положению. После этого заполните стимулирующую пипетку раствором ACSF-normal, содержащим красный флуорофор. Опустите его сверху на срез так, чтобы кончик оказался в той же области, что и интересующая ячейка.

После этого наполните пипетку для пластыря раствором и прикрепите ее к головному столику. Установите его над срезом так, чтобы его кончик находился прямо над интересующей клеткой. Впоследствии вставьте шприц в трехходовой запорный кран, и подключите его к патч-пипетке через пластиковую трубку.

Подавайте постоянное положительное давление в патч-пипетку и удерживайте запорный кран в близком положении. Далее откройте программный модуль управления усилителем MultiClamp, и переключитесь в режим Voltage Clamp, нажав на кнопку VC. Откройте программное обеспечение для сбора данных Electrophysiology Clampex для записи электрофизиологических сигналов и нажмите на значок Membrane Test, чтобы отправить постоянный импульс квадратного напряжения для мониторинга изменений сопротивления пипетки.

Теперь опустите дозатор пластыря так, чтобы он оказался прямо над целевой клеткой. При контакте с клеточной мембраной снимите давление, повернув запорный кран в открытое положение. Затем с помощью пустого шприца, вставленного в запорный кран, приложите небольшое отрицательное давление к патч-пипетке, пока сопротивление пипетки не достигнет одного гигаома.

В окне Membrane Test программного обеспечения для сбора данных зажмите ячейку при отрицательном напряжении 60 милливольт. Продолжайте оказывать отрицательное давление до тех пор, пока сопротивление пипетки не упадет и не будет достигнута конфигурация с цельными ячейками. В программном модуле управления усилителем MultiClamp установите конфигурацию патча на текущий зажим, нажав на кнопку IC, и запишите свойства мембраны в ответ на соматические инъекции гиперполяризующих и деполяризующих токов.

Подождите не менее 30 минут, пока ячейка заполнится индикаторами, присутствующими в растворе патча. Чтобы получить изображения, найдите интересующий дендрит с помощью красного флуоресцентного сигнала. Обеспечьте видимый отклик, выбрав проксимальный дендрит короче 50 микрометров, так как эффективность обратного распространения AP может значительно снижаться с расстоянием в ГАМКергических интернейронах, и переключитесь в режим xt.

С помощью контроллеров интенсивности лазера установите двухфотонный лазер на минимальный уровень мощности, при котором базовая зеленая флуоресценция лишь слегка видна, чтобы избежать фототоксичности. Впоследствии, в программном обеспечении для сбора данных электрофизиологии Clampex, окне протокола и программном обеспечении для получения изображений, создайте запись желаемой продолжительности, содержащую инжекцию соматического тока желаемой амплитуды. После этого нажмите кнопку «Начать запись» и непрерывно регистрируйте флуоресценцию в течение одной-двух секунд.

Повторите процесс получения изображения от трех до 10 раз. Подождите не менее 30 секунд между одиночными сканированиями, чтобы избежать фотоповреждений. Чтобы зарегистрировать дендритные кальциевые переходные процессы, вызванные электрической стимуляцией, найдите интересующий дендрит с помощью красного флуоресцентного сигнала.

Установите стимулирующую пипетку на поверхность среза над интересующим дендритом. Медленно опускайте дозатор стимуляции на 10–15 микрометров от дендрита, сводя к минимуму движение, чтобы не нарушить конфигурацию всей клетки. Чтобы визуализировать расположение синаптических микродоменов в аспинных нейронах, в программном обеспечении для получения изображений переключитесь в режим xt и расположите линию вдоль интересующей дендритной ветви.

В окне Протокол создайте пробную запись, которая инициирует стимуляцию. Используя программное обеспечение для сбора данных, непрерывно сканируйте дендрит в течение одной-двух секунд. Повторите сбор данных от трех до пяти раз, подождая 30 секунд между сканированиями, чтобы предотвратить фотоповреждение.

Чтобы получить предварительную информацию о морфологии клетки и вести учет расположения стимуляционной пипетки, приобретите Z-стек клетки в красном канале. Используя программное обеспечение для сбора данных в режиме xyz, установите верхний и нижний пределы стека, чтобы получить изображение всей ячейки со всеми включенными процессами. Затем установите размер шага в один микрометр и запустите сбор стека с помощью кнопки «Начать запись».

Когда сбор данных Z-стека будет завершен, используйте параметр «Максимальная проекция» в программном обеспечении, чтобы наложить все фокусные планы стека и проверить качество сбора. Затем медленно втяните патч-пипетку из среза. Чтобы зафиксировать срез для апостериорной морфологической идентификации, быстро выньте срез из ванны с помощью кисти и поместите его между двумя фильтровальными листами в чашке Петри, заполненной ACSF.

Замените ACSF 4% раствором параформальдегида и оставьте в посуде при температуре четыре градуса Цельсия на ночь. На этом рисунке максимальная проекция двухфотонного Z-стека показывает патчированный интернейрон, заполненный Alexa-594. Белые стрелки указывают на расположение аксональных окончаний в пирамидальном слое, предполагая, что интернейрон является корзинной клеткой.

На этом рисунке показана дендритная ветвь, рядом с которой был расположен стимулирующий электрод. Пунктирная линия показывает место сканирования линии. На приведенных здесь изображениях показан результат линейного сканирования в красном и зеленом каналах.

Повышение флуоресценции зеленого цвета во время стимуляции указывает на повышение концентрации кальция в этой области. Изображения могут быть разбиты на более мелкие сегменты, что позволяет анализировать разброс отклика. На приведенных здесь следах показаны переходные процессы кальция, возникающие в различных сегментах в ответ на электрическую стимуляцию, зарегистрированную на соматическом уровне во время исследования визуализации.

Амплитуда кальциевых транзиентов уменьшается с удалением от центральной горячей точки, что указывает на пространственную локализацию реакции. После этой процедуры могут быть выполнены другие методы, такие как потенциал-чувствительная визуализация красителя или оптогенетика, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как локальные изменения потенциала памяти в дендритных ветвях или интеграция конкретных входов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как контролировать зависимые от активности колебания кальция в нейрональных дендритах с помощью комбинации оптофизиологических методов, которые будут полезны для изучения тонкостей интеграции дендритного входа и пластичности.