Рассечение и пятнать дрозофилы куколки яичников

Общая цель этой процедуры заключается в пресечении и окрашивании яичников куколки дрозофилы. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы развития биологии, например, на вопросы дифференцировки стволовых клеток и развития тканей модельного организма дрозофилы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что используются настраиваемые инструменты для приспособления к небольшому размеру и полупрозрачному характеру яичников куколки, которые в противном случае трудно изолировать.

Идея использовать его метод возникла у нас, когда мы проводили эксперименты с течением времени, чтобы проследить деление стволовых клеток в яичнике во время развития куколки дрозофилы. Чтобы начать протокол, объедините 10 самцов и 15 самок взрослых мух дрозофил во флаконе с обычным жирным кормом для мух с добавлением дрожжей. Дайте яйцам развиться в личинки при комнатной температуре в течение трех-четырех дней.

Через три-четыре дня с помощью влажной тонкой щетки с мягкой щетиной сделать вращательное движение щеткой вдоль стенки флакона, перенести блуждающих личинок третьего возраста, из флакона в стеклянный колодец, наполненный до краев 1Х фосфатным буферным раствором или PBS. Смойте остатки пищи с личинок, перенеся их в другую лунку, наполненную 1X PBS. Отделите личинки мужского и женского пола с помощью щипцов.

Личинки самцов идентифицируются по паре больших круглых и полупрозрачных семенников, внедренных в жировое тело на боковой стороне на две трети вниз от его переднего конца. Затем соберите не менее 10 самок из лунки и поместите личинок самок в отдельную лунку, наполненную 1Х ПБС. С помощью щипцов аккуратно переложите личинок самок в новый флакон со свежим кормом для мух с добавлением дрожжей.

Поместите флакон с личинками самок в темное место, чтобы облегчить окукливание. В течение дня следите за личинками на предмет окукливания. По мере того, как каждая личинка лобализуется и развивается в предкуколку, обведите предкуколку вокруг флакона и запишите приблизительное время, когда она впервые формируется в предкуколку.

Расплавьте стеклянный наконечник дозатора над горелкой Бунзена. По мере того, как стекло плавится, с помощью щипцов оттягивайте наконечник горизонтально от остальной части пипетки, чтобы сформировать более тонкий наконечник. После остывания отломите небольшую часть наконечника пипетки, чтобы образовалось аккуратное круглое отверстие.

Прикрепите лампочку к другому концу пипетки и загрузите в пипетку 1X PBS. Для сбора урожая куколки приклеивают к стенке флакона, наносят небольшую каплю воды вдоль зоны контакта между куколкой и флаконом. Дав белковому клею раствориться в течение одной-двух минут, аккуратно оторвите куколку от стены влажной тонкой щеткой.

Переведите одну куколку в лунку, наполненную 1X PBS. Захватывая задний конец куколки одной парой щипцов, осторожно разорвите переднюю часть куколочного корпуса другой парой до тех пор, пока не станет видна головка куколки. Захватите щипцами самый передний кончик головки куколки и осторожно вытащите куколку из ее куколочного корпуса.

Затем отделите и отбросьте переднюю половину куколки от задней половины, пока не останется только брюшной мешок. Возьмитесь за брюшной мешок у дна лунки щипцами в одной руке, а в другой руке держите тонкую стеклянную пипетку, наполненную 1X PBS. Направьте тонкий кончик пипетки к отверстию мешочка и медленно введите пипетку 1X PBS в брюшную полость, чтобы смыть жировые клетки организма, окружающие яичники куколки.

Смывайте жировые клетки тела до тех пор, пока не исчезнет по крайней мере две трети жирового тела или пока яичники не станут видны возле отверстия брюшного мешка. Если яичники не видны внутри колодца, они должны были остаться в брюшной полости. Если яичники вышли, поместите в лунку новую куколку и повторите этот шаг.

Перенесите брюшную полость в прозрачную стеклянную камеру, заполненную фиксирующим буфером, и накройте сверху крышкой. Препарируйте больше яичников, чем необходимо, чтобы убедиться, что достаточное количество яичников выстоит в процессе окрашивания и монтирования. На протяжении всего процесса окрашивания с помощью щипцов аккуратно надавливайте на любые плавающие яичники на дно закрытого стеклянного колодца, чтобы убедиться, что яичники полностью погружены в раствор антител.

Поместите полоски двустороннего скотча на плоскую поверхность нового титра, а затем поместите камерное покровное стекло, содержащее яичники и фиксирующий буфер, на адгезивную поверхность. Инкубируйте яичники в фиксирующем буфере в течение 15 минут при комнатной температуре. Затем промойте яичники три раза в 1X PBS с 1% Triton X-100 или 1% PBST в течение пяти, 10 и 45 минут соответственно, чтобы обеспечить полную пермеабилизацию.

Заблокируйте яичники в 10% нормальной козьей сыворотке в 0,5% PBST на 30 минут. Затем инкубируйте яичники в течение ночи в 600 микролитрах первичного антитела в 0,5% PBST при 4% Цельсия. На следующий день промойте яичники три раза по пять минут каждый в 0,5% PBST.

Инкубировать яичники в течение двух часов в 600 микролитрах вторичного антитела, разведенного в 0,5% PBST при комнатной температуре. После инкубации промойте яичники дважды в течение пяти минут в 0,5% PBST и один раз в течение пяти минут в 1X PBS. Нанесите небольшую каплю 1X PBS на предметное стекло микроскопа.

С помощью щипцов перенесите брюшной мешок из камерного покровного стекла в стакан, наполненный 1x PBS. Разорвите брюшной мешок и остатки жира с помощью щипцов. Перенесите яичники из лунки в каплю 1x PBS на предметном стекле микроскопа, захватив центр яичников между кончиками щипцов.

Добавьте несколько капель 1X PBS на предметное стекло, когда раствор высохнет. После того, как все яичники будут препарированы и перенесены на предметное стекло микроскопа, нанесите пипеткой 40 микролитров монтажной среды на защитное стекло размером 22 x 22 мм и аккуратно поместите защитное стекло на верхнюю часть яичников. Наконец, дайте предметному стеклу высохнуть в течение ночи перед визуализацией.

Иммуногистохимия, специфичная для пролиферации клеток, такая как окрашивание фосфогистоном H3, может быть использована для изучения паттернов деления стволовых клеток и других митотически активных типов клеток. Клетки стебля куколки, полученные из роевых клеток, могут быть обведены окрашиванием Fasciclin III. При попытке выполнить эту процедуру, лучше всего собрать и препарировать больше PB, чем необходимо для эксперимента, учитывая, что некоторые яичники могут быть потеряны во время экстракции жирового тела или иммуногистохимии.

Спасибо за просмотр и удачи в эксперименте.