Количественное измерение γ-Secretase опосредованной амилоида прекурсоров протеина и вырез декольте в платформах Assay репортера Cell-based Люцифераза

Общей целью данного количественного анализа репортерных генов на основе клеток для гамма-секретазы является изучение дифференциального влияния предполагаемых модуляторов гамма-секретазы на гамма-секретазу-опосредованное расщепление. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области болезни Альцгеймера, такие как идентификация новых модуляторов гамма-секретазы для лечения болезни Альцгеймера. Преимущество этой методики заключается в том, что это высокоэффективная система анализа, и она может легко идентифицировать модуляторы гамма-секретазы.

Применение этого метода распространяется на терапию болезни Альцгеймера через потенциальное открытие препаратов против болезни Альцгеймера с минимальными побочными эффектами. Этот метод может дать представление о субстратной селективности гамма-секретазы. Он также может быть применен для изучения других заболеваний, таких как нейробластома.

У новичков в этом методе могут возникнуть трудности с тщательным удалением и добавлением питательных сред клеточных культур к 96 микропланшетам, так как слишком большое возмущение может усложнить конечные результаты. Начните эту процедуру с препарирования НГ и КГ клеток, как указано в текстовом протоколе. Подсчитайте НГ или CG клетки с помощью гемоцитометра.

Затем засейте клетки по 20 000 клеток на лунку на 96-луночные микропланшеты с конечным объемом 200 микролитров на лунку в питательной среде. Перенесите микропланшеты в инкубатор с увлажненным углекислым газом и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи. После ночной инкубации удалите по 100 микролитров питательной среды из каждой лунки.

Добавьте 100 микролитров на лунку питательной среды, содержащей два микрограмма на миллилитр тетрациклина с 0,2% диметилсульфоксида, двумя микромолярными CL-387, 785, двумя микромолярными DAPT или другими родственными ингибиторами ErbB1/ErbB2. Инкубируйте обработанные клетки и микропланшеты при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. После инкубации удалите из микропланшетов 150 микролитров питательной среды на лунку.

Затем добавьте 50 микролитров на лунку реактива для анализа люциферазы. Далее перенесите микропланшеты в люминесцентный считыватель микропланшетов и поддерживайте их при комнатной температуре в течение пяти минут. Определите люминесценцию, излучаемую люциферазой светлячка, с помощью предопределенной программы, хранящейся в считывателе микропланшетов люминесценции.

Сначала откройте программное обеспечение для управления прибором. Затем в меню «Инструмент» выберите «Люминометрия». В настройках «Параметры» выберите «Без фильтра» для фильтра излучения, отметьте галочкой «Нормаль» для диафрагмы излучения, введите единицу для подсчета времени и нажмите «ОК», чтобы настроить показания люминесценции.

На вкладке Управление прибором прокрутите список активных протоколов и выберите предварительно сохраненный протокол для считывания люминесценции. На вкладке Отображение в реальном времени задайте масштаб в раскрывающемся меню и выберите тип Логарифм или Линейный. На вкладке Температура выберите Выкл для нагрева пластины.

Наконец, нажмите кнопку «Пуск», чтобы выполнить считывание люминесценции. Экспортируйте результаты в формат электронной таблицы с помощью проводника, встроенного в управляющее программное обеспечение. Оцените фоновую люминесценцию клеток CG или NG, обработанных питательной средой, не содержащей тетрациклин.

Определите люминесцентный сигнал, испускаемый CG или NG-клетками, обработанными 0,1% ДМСО в питательной среде, содержащей один микрограмм на миллилитр только тетрациклина, как 100% относительную активность гамма-секретазы. Наконец, нормализуйте сигналы люциферазы от клеток CG или NG, культивируемых питательной средой, содержащей тетрациклин и CL-387, 785 или DAPT, до сигнала люциферазы, излучаемого обработанными ДМСО клетками CG или NG. Здесь представлены репрезентативные результаты, демонстрирующие количественные измерения расщепления гамма-секретазы APP-C99 в клетках CG.

Клетки обрабатывали одним микромоляром CL-387, 785 или DAPT в присутствии одного микрограмма на миллилитр тетрациклина при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Люминесценцию, полученную в результате гамма-секретазы-опосредованного протеолиза C99-GV, количественно определяли после добавления 100 микролитров на лунку реагента для анализа люциферазы. Сигнал люциферазы, излучаемый клетками, обработанными только носителем, был установлен как 100% относительная люминесценция.

Представлены репрезентативные результаты, демонстрирующие количественные измерения расщепления гамма-секретазы N-дельта-Е в NG-клетках. Аналогичным образом, клетки обрабатывали одним микромоляром CL-387, 785 или DAPT в присутствии одного микрограмма на миллилитр тетрациклина при температуре 37 градусов Цельсия в течение 24 часов. Люминесценцию, полученную в результате гамма-секретазы-опосредованного протеолиза N-дельта-E-GV, количественно определяли после добавления 100 микролитров на лунку реагента для анализа люциферазы.

Сигнал люциферазы, излучаемый клетками, обработанными только носителем, был установлен как 100% относительная люминесценция. После освоения этой техники требуется всего один-два часа, в зависимости от количества исследуемых соединений. После своего развития этот метод проложил путь для исследователей в области болезни Альцгеймера к изучению генетического и химического модификатора гамма-секретазы в поисках новых методов лечения болезни Альцгеймера.