Выявление и количественная оценка Plasmodium falciparum в водный красных кровяных клеток, ослабленных общее отражение инфракрасной спектроскопии и многомерного анализа данных

Общая цель этой процедуры заключается в создании регрессионные модели для прогнозирования малярийной паразитмии с использованием спектроскопии ATR-FTIR с многовариантным анализом данных. Этот метод может помочь ускорить диагностику точки оказания медицинской помощи, которая может помочь улучшить исходы пациентов в будущем. Основным преимуществом этой техники является то, что, хотя модель может занять некоторое время, чтобы построить, это очень портативный, удобный, очень чувствительный, и недорогой.

Хотя этот метод позволяет количественно определить малярийных паразитов, он также может быть использован для наблюдения фенотипической реакции на экологические изменения, такие как изменения в составе паразитов из-за противомикробных агентов. Идея, разработанная на основе работы, которую мы сделали в Австралийском синхротроне по зараженным малярией клеткам. Это было на одноклеточном уровне.

Оттуда мы решили использовать спектроскопию ATR-FTIR для разработки диагностического теста. До начала процедуры синхронизации, культура 30 миллилитров штамма 3D7 Plasmodium falciparum паразитов, как описано в текстовом протоколе. Используя автоматизированную пипетку, перерасходуйте культуру и перенесите ее в 50-миллилитровую коническую трубку.

Центрифуга культуры в 300-400 раз г при стандартных лабораторных условиях в течение пяти минут. Удалите супернатант, нарисовав его с помощью автоматической пипетки, не нарушая гранулы. Отбросьте отходы в раствор 10%bleach.

Медленно добавьте от 12 до 15 миллилитров раствора 4% сорбитола в гранулы и смешайте культуру, укупорки и инвертирования трубки, пока культура однородна. Инкубировать культуру при 37 градусах по Цельсию в течение 15 минут. Через 15 минут центрифуга культуры в течение пяти минут.

Используйте автоматизированную пипетку, чтобы удалить супернатант, не нарушая гранулы. Добавьте от 10 до 15 миллилитров 0,9% солевого раствора в гранулы и смешайте раствор, укупорки и инвертирования трубки, пока культура не станет однородной. Повторите центрифугации и солевой раствор мыть еще два раза, чтобы удалить все остатки сорбитола.

Чтобы начать эту процедуру, центрифуга запас красных кровяных телец, или РБК. Удалить супернатант и мыть с 0,9% солевого раствора в общей сложности в три раза. Центрифуга фондовых РБК и культуры на 300 до 400 раз г в течение пяти минут и отказаться от супернатанта из каждой трубки.

Этикетка восемь микроцентрифуг трубки, как указано. Затем используйте пипетку с 0,2 до 20 микролитров, чтобы добавить соответствующее количество культуры к каждой трубке. Далее добавьте соответствующее количество запасов РБК в каждую трубку, чтобы получить желаемое разбавление паразитмии.

Центрифуга свежей донорской крови, собранной в антикоагулянтных трубках при 1200 г и стандартных лабораторных условиях в течение 10 минут. Удалите плазму, нарисовав ее пипеткой и выбросив ее в 10%bleach раствор. Добавьте 900 микролитров изолированных донорских РБК в каждую микроцентрифугную трубку и тщательно перемешайте, инвертировал 10 раз.

Для приобретения спектра будет использоваться простой скамейка Attenuated Total Reflection Fourier Transform Infrared, или спектрометр ATR-FTIR. Подготовка и очистка кристалла с помощью ворса без салфетки смоченной ультра-чистой водой, чтобы аккуратно скраб кристалла круговыми движениями. Затем используйте другую салфетку без ворса, чтобы тщательно высушить кристалл.

Сделайте фоновое измерение воздуха, нажав на фоновое измерение. Каждые 20 минут очищайте кристалл и повторяйте это измерение. Откройте живой вид, нажав Предварительный просмотр.

Наблюдайте плоский горизонтальный базовый уровень, указывающий на чистоту кристалла. Pipette 10 микролитров деионизированной воды непосредственно на середину кристалла и нажмите Мера Образец. Высушите кристалл, используя обтираемую без ворса и нежное круговое движение.

Pipette 10 микролитров образца на середину кристалла и нажмите Мера Образец. Очистите кристалл между образцами. В этой демонстрации многовариантный анализ данных будет проводиться с помощью MATLAB.

Чтобы начать обработку данных, ввемите анализ в командное окно, чтобы открыть графический пользовательский интерфейс. Нажмите правой кнопкой мыши X-поле, чтобы найти данные об импорте. Выберите тип файла для анализа.

Импортная выборка, вода и базовые спектры в качестве наборов данных на рабочем месте, выбирая все спектры в каждом наборе отдельно, нажав Open, и давая каждому набору короткое имя. Нажмите New Variable в командном окне и дайте вектору имя Parasitemia. Вввемия Паразитмии каждого образца.

Нажмите правой кнопкой мыши X поле, чтобы найти Участок данных. Нажмите значок данных участка, чтобы построить данные. Проинспектировать спектры воздействия водяного пара, нажав Увеличить и масштабирования на 1, 800 до 1, 400 процентов, наиболее четко наблюдается как короткие, острые, узкие пики вдоль склонов Амиде I и Amide II полос.

В случае экстремального водяного пара откройте вкладку данных Edit Preprocess и выберите Smoothing. Уменьшите шум и/или сильный вклад водяного пара путем сглаживания образца и спектра воды. После дальнейшей обработки данных, описанной в текстовом протоколе, откройте вкладку Edit Data и в переменных столбцах выберите 2980-2800 процентов сантиметров и от 1750 до 850 процентов, убедившись, что только их коробки тикают.

Данные уже готовы к анализу. Для выполнения основного анализа компонентов, или PCA, нажмите Анализ разложения и выберите PCA. Нажмите Модель сборки.

Наблюдайте предел доверия 95%, dashed кольцо, на графике счетов между PC 1 и PC 2. Используйте инструмент Select Spectra, чтобы отметить спектры выборки баллами, которые происходят за пределами предела в качестве потенциальных выбросов. Для выполнения частичной регрессии квадратов, или PLSR, нажмите Анализ регрессии и выберите PLSR.

Нажмите правой кнопкой мыши на блок Y и выберите векторную модель сборки Parasitemia. Проанализируйте модель регрессии и вектор регрессии и определите биологические полосы. Частичный наименее квадратов регрессии участок РБК шипами от нуля до одного процента Parasitemia генерируется R-квадрат значение 0,87 и корень среднего квадрата перекрестной проверки ошибка 0,13%Parasitemia.

Это демонстрирует способность модели предсказывать Паразитмию в каждом образце с известной Паразитмией на х-оси и предсказанной Паразитмией на оси. Связанный с этим коэффициент регрессии описывает вклад каждой группы в прогностический потенциал модели. Чем интенсивнее полоса, тем больше она вносит свой вклад в модель, и, таким образом, как паразит изменяет химический состав крови.

Результаты показывают, что сигнал от паразитов достаточно отличается от РБК, что они могут быть использованы для формирования линейной регрессионные модели для прогнозирования паразитов в будущих наборов данных. После освоения, этот метод может занять менее трех минут на образец, если выполняется должным образом. При попытке этой процедуры, важно помнить, чтобы очистить кристаллы ATR всех остатков.

После этой процедуры, другие виды малярии, такие как P vivax и P malariae могут быть смоделированы для того, чтобы ответить на такие вопросы, как, Является ли спектроскопия ATR-FTIR достаточно чувствительной, чтобы различать виды? После своего развития, этот метод проложил путь для исследователей в области биоспектроскопии для изучения обнаружения и количественной оценки других патогенов, передающихся через кровь и даже анализировать в крови, таких как глюкоза и мочевина. После просмотра этого видео, вы должны иметь хорошее понимание спектроскопии ATR-FTIR и анализа NVDA для создания регрессионные модели.

Не забывайте, что работа с образцами крови пациента и малярии может быть опасной, и соответствующие тренировки уровня биобезопасности и сдерживания всегда должны быть сделаны при попытке этой процедуры.