Фталевая кислота Эстер связывания ДНК Aptamer выбор, характеристика и применение к электрохимическим Aptasensor

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы отобрать группоспецифичные ДНК-аптамеры к высокогидрофобным малым молекулам и использовать выбранный аптамер для разработки чувствительного электрохимического биосенсора. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области выбора аптамеров, о том, как выбрать и охарактеризовать группоспецифичные аптамеры, когда мишенями являются высокогидрофобные молекулы. В то время как наиболее полезной частью этого метода является разработка электрохимических биосенсоров для обнаружения титулов.

Эти биосенсоры также должны работать для измерения аффинности аптамеров. Чтобы начать реакцию, добавьте 100 микролитров воды, не содержащей РНКазы, в очищенный аптамер ПЦР. Перебейте смесь вихрем до тех пор, пока осадок не растворится.

Реакция экзонуклеазы лямбда чувствительна к концентрации соли и является продуктом, который должен распространяться путем осаждения этанола, но другого изопропанола. Поместите в каждую из пяти микроцентрифужных пробирок по пять микролитров раствора аптамера, 11 микролитров свободной воды Rnase и два микролитра 10-кратного реакционного буфера. Добавьте по одной пробирке два микролитра воды, свободной от РНАЗы, и растворы двух, пяти, восьми и 10 единиц лямбда-экзонуклеазы в воде, свободной от РНАЗы.

Хорошо перемешайте с помощью щадящей пипетки. Инкубируйте пробирки при температуре 37 градусов Цельсия в течение 35 минут и при температуре 80 градусов Цельсия в течение 15 минут. Затем держите пробирки при температуре четыре градуса Цельсия и приготовьте 12% нативный гель.

Добавьте в каждую пробирку по одному микролитру загрузочного красителя и четыре микролитра воды, свободной от Рназы. Запустите смеси в родной странице геля при напряжении 150 вольт в течение 45 минут. Определите наименьшее количество лямбда-экзонуклеазы, необходимое для полного создания одноцепочечной ДНК.

Выполните крупномасштабную реакцию для получения одноцепочечной ДНК. Для каждой тестируемой мишени связывания инкубируют 10 микролитров средних функционализированных магнитных шариков, кодированных DBP, с 500 микролитрами одного микромолярного раствора DBP-1 в течение одного часа при комнатной температуре при вращении. Затем выбросьте надосадочную жидкость.

Промойте шарики четыре раза порциями 200 микролитров буфера для связывания PAE и повторно суспендируйте шарики в 10 микролитрах буфера для связывания PAE. Получите 10 микромолярных целевых тестовых дисперсий связывания в буфере для связывания PAE. Отлично подходит для диспергирования гидрофобных мишеней в буфере, связывающем PAE.

Для того, чтобы убедиться в этом, происходит обогащение библиотеки, были отобраны по аффинити-тестам. Добавьте 10 микролитров шариков с кодировкой DBP-1 к 110 микролитрам каждого целевого тестового раствора. Инкубируйте смеси в течение одного часа и соберите надосадочную жидкость путем магнитной сепарации.

Разведите надосадочную жидкость в 100 раз и используйте по три микролитра на каждую количественную ПЦР. Рассчитайте относительное сродство путем деления количества DBP-1, высвобождаемого в присутствии испытуемого образца, на количество DBP-1, высвобождаемого только в буфере связывания PAE. Перед проведением измерений синтезируют и очищают зонд последовательности тиолированного ядра DBP-1 и сигнальный зонд.

Восстановите тиолированный зонд и сигнальный зонд в виде 100 микромолярных растворов в воде, свободной от нуклеаз. Затем отполируйте золотой электрод диаметром два миллиметра до зеркальной поверхности с порошком оксида алюминия толщиной 0,3 и 0,5 микрона и салфеткой из микрофибры в течение пяти минут каждый. Ультразвуком обрабатывайте электрод в ультрачистой воде в течение пяти минут после каждой полировки.

Погрузите полированный электрод в 0,5 молярного раствора серной кислоты. Очистите электрод с помощью 35 последовательных циклических вольтамперометрических сканирований от минус 0,4 до положительных 1,2 вольт против ртутного каломеля при 100 милливольтах в секунду. Далее готовят в тонкостенной центрифужной пробирке смесь 0,5 микромолярного тиолированного зонда ДБП-1.

А 0,5 микромолярного ФК модифицированного DBP-1 в 100 микролитрах PBS. Нагрейте смесь на водяной бане, установленной при температуре 95 градусов Цельсия, в течение 10 минут. Затем дайте смеси остыть до комнатной температуры на водяной бане.

Добавьте в остывшую смесь один микролитр 10 миллимолярного стокового раствора TCEP и выдержите при комнатной температуре в течение одного часа. Затем погрузите чистый золотой электрод в смесь на 12 часов при комнатной температуре. Промойте электрод PBS, а затем погрузите электрод в одномиллимолярный раствор тиолированного PEG в PBS на один час.

Тщательно промойте электрод буфером, связывающим PAE без мишени, и погрузите электрод в буфер. Затем ультразвуковые электролитические ячейки платинового контрэлектрода и насыщенного каломельного электрода сравнения в течение двух минут каждая в ультрачистой воде и буфере для связывания PAE последовательно. Откройте программу «Прямоугольная волна вольтамперометрического прибора» и введите параметры эксперимента.

Заполните чистую электролитическую ячейку буфером для связывания PAE без мишеней. Подсоедините три чистых электрода к потенциостату и погрузите электроды в буфер. Получите фоновое сканирование SWV.

Затем погрузите золотой рабочий электрод в 10 пикамолярный раствор DEHP в буфер для связывания PAE на 30 минут при комнатной температуре. Тщательно промойте электрод связывающим буфером PAE. Погрузите все три электрода в свежий буфер для связывания PAE и соберите еще одну кривую SWV, используя те же параметры, что и раньше.

Повторите этот процесс с увеличением концентрации DEHP, чтобы получить кривую титрования. Было обнаружено, что минимальное количество лямбда-экзонуклеазы, необходимое для получения только одноцепочечной ДНК, составляет две единицы на основе мелкомасштабных реакций. Кандидат в аптамеры DBP-1 был идентифицирован с помощью SELEX с последующим высокопроизводительным секвенированием.

DBP-1 показал хорошую групповую специфичность к конгенерам PAE. Электрохимический аптасенсор с использованием DBP-1 селективно реагировал на DEHP по отношению к другим распространенным загрязнителям окружающей среды. Аптасенсор был высокочувствителен к DEHP с ответом при концентрациях до 10 пикамоляров.

Лазерная частица, где осуществляется селекция и характеризация аптамеров на опасность гидрофобных малых молекул. Определение характеристик и испарение аптамеров гидрофобных малых молекул, таких как PAE, как правило, является довольно сложной задачей из-за крайне ограниченной растворимости в воде и низкой молекулярной массы PAE. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как сделать электрохимические аптасенсоры и как с их помощью обнаруживать титры.