Геном широкий количественная оценка перевода в многообещающий дрожжей рибосома профилирования

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы определить, какие участки мРНК транслируются в белки, количественно измерить трансляцию белка в почковающихся дрожжах Saccharomyces cerevisiae на уровне всего генома. Профилирование рибосом может быть использовано для мониторинга скорости белка и заболевания, а также для изучения механизмов трансляционной регуляции. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она добавляет гораздо большую чувствительность по сравнению с другими методами, причем из тех, которые измеряют белки и заболевание in vivo с разрешением одного контакта.

Хотя этот протокол специфичен для почковающихся дрожжей, он также полезен для исследователей, которые пытаются установить профилирование рибосом в других модельных системах, таких как клетки и ткани млекопитающих. Экстракты будут приготовлены из дрожжевых клеток, выращенных до середины логарифмической фазы. Используйте фильтрующий узел со стеклянным держателем для фильтрации культуры через фильтры с микромембраной 0,45

Соскребите гранулу шпателем, мгновенно заморозьте в жидком азоте и храните при температуре минус 80 градусов по Цельсию. Поместите три шарика из хромистой стали 3,2 миллиметра в трубку из нержавеющей стали объемом 1,8 миллилитров и предварительно охладите трубку в жидком азоте. Добавьте замороженные гранулы и накройте стальную трубку крышкой из силиконовой резины.

Гомогенизируйте образец путем криошлифования в течение 10 секунд при 4200 об/мин. Чтобы образцы оставались замороженными в течение всей процедуры измельчения, крайне важно охлаждать пробирку в жидком азоте не менее 10 секунд между каждым измельчением. Когда гомогенизация будет завершена, добавьте в образец один миллилитр буфера для лизиса, который содержит циклогексимид.

Хорошо перемешайте с помощью пипетирования и переложите образец в новую пробирку объемом 1,5 миллилитров. Центрифугируйте при 20 000 умноженных на g при четырех градусах Цельсия в течение пяти минут. Переложите надосадочную жидкость в новую трубку объемом 1,5 миллилитров.

Перенесите 100 микролитров лизата в другую новую пробирку объемом 1,5 миллилитра для выделения поли(А)мРНК. Заморозьте пробирки с образцами мРНК на остальной части лизата, который будет использоваться для извлечения отпечатка следа в жидком азоте, и храните при температуре минус 80 градусов Цельсия. В ночь перед извлечением следа разморозьте заранее подготовленные градиенты сахарозы при четырех градусах Цельсия.

На следующий день разморозьте лизат клеток на льду. Переложите аликвоту клеточного лизата, содержащую 50 единиц OD260, в новую пробирку объемом 1,5 миллилитров, добавьте свежий буфер для лизиса до одного миллилитра и 10 микролитров РНКазы. Инкубируйте при комнатной температуре с мягким вращением на вращателе в течение одного часа.

Затем аккуратно нанесите образец лизата поверх градиента сахарозы от 10% до 50% в полимерных пробирках. Используя ротор SW41 ti, ультрацентрифуга со скоростью 35 000 об/мин при четырех градусах Цельсия в течение трех часов. Во время ультрацетрифугации настройте систему градиентного фракционирования.

Включите компоненты и дайте УФ-монитору прогреться не менее 30 минут. Наполните шприц раствором для погони и удалите все пузырьки воздуха внутри шприца и канюли. Когда ультрацентрифугирование будет завершено, установите и проткните ультрацентрифужную пробирку, содержащую градиент сахарозы.

Запустите шприцевой насос с точностью до одного миллилитра в минуту и соберите одну миллилилитровую фракцию, контролируя значения A254. Фракции, представляющие пик моносомы ADS, собираются и объединяются. Отфильтруйте фракции через центробежные фильтры объемом 0,5 миллилитра при температуре 12 000 м g при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, отбросьте проточную часть и повторяйте до тех пор, пока объем не станет меньше 100 микролитров.

При выделении 400 мкл буфера смешивают пипетированием и инкубируют на льду в течение 10 минут, переносят установку в новую сборную пробирку и центрифугируют при 12 000 умноженных на g при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут. Соберите протекание. Затем очистите фрагменты следа и осаждайте образцы с помощью осаждения этанола, как описано в текстовом протоколе.

Чтобы начать эту процедуру, центрифугируйте осажденный след и фрагментированные образцы мРНК при температуре 20 000 g и четырех градусах Цельсия в течение 30 минут. После удаления этанола и сушки гранул на воздухе мы суспензируем каждую гранулу в 7,75 микролитрах воды. К каждой грануле добавьте один микролитр буфера полинуклеотидкиназы 10XT4, один микролитр полинуклеотидкиназы Т4 и 0,25 микролитра ингибитора РНКазы.

Выдерживать при температуре 37 градусов Цельсия в течение одного часа. Добавьте 10 микролитров буфера для образцов мочевины 2X TBE к 10 микролитрам каждого отпечатка и образца мРНК. Инкубируйте образцы и соответствующие контрольные элементы при температуре 75 градусов Цельсия в течение трех минут, убавьте обороты и положите на лед на одну минуту.

Загрузите каждый образец в две лунки с 15%-ным гелем мочевины TBE и отделите фрагменты РНК с помощью гель-электрофореза при напряжении 180 вольт в течение одного часа. Окрасьте гель гелевым пятном с нуклеиновой кислотой, защищенным от света в течение пяти минут. Визуализируя гель под синим световым трансиллюминатором, вырежьте правильную полосу между 28 и 32 нуклеотидами для образцов отпечатков ног и от 50 до 70 нуклеотидов для образцов мРНК.

Заморозьте исчерпанные кусочки полиакриламидного геля при температуре минус 80 градусов Цельсия не менее чем на 10 минут перед извлечением РНК из полиакриламидного геля. Перед обратной транскрипцией выполните лигирование трех первичных адаптеров и осадите образцы, как описано в текстовом протоколе. Суспендируйте каждую гранулу в 11,5 микролитрах воды, не содержащей нуклеаз.

Затем добавьте 0,5 микролитра восьмимикролярного праймера обратной транскрипции и один микролитр смеси dNTP. Выдерживайте при температуре 65 градусов Цельсия в течение пяти минут, а затем положите на лед. К каждому образцу добавьте четыре микролитра 5-кратного буфера первой цепи, два микролитра 0,1 молярного DTT, 0,5 микролитра ингибитора РНКазы и 0,5 микролитра обратной транскриптазы.

Инкубируйте при температуре 48 градусов Цельсия в течение 30 минут, при температуре 65 градусов Цельсия в течение одной минуты и при температуре 80 градусов Цельсия в течение пяти минут. Приступайте непосредственно к гидролизу РНК, добавив в каждый образец по 0,8 микролитра двух моляров гидроксида натрия и инкубируя при температуре 98 градусов Цельсия в течение 30 минут. Добавьте 0,8 микролитра двух моляров хлористого водорода для нейтрализации реакции.

После осаждения образцов, как описано в текстовом протоколе, повторно суспендируйте каждую гранулу в пяти микролитрах воды, не содержащей нуклеаз, и добавьте пять микролитров 2x буфера для образцов мочевины TBE. Инкубируйте при температуре 75 градусов Цельсия в течение трех минут, вращайте медленнее и лед в течение одной минуты. Загрузите образец в одну лунку с гелем мочевины 10% TBE.

Отделите продукты реакции обратной транскрипции гель-электрофорезом при напряжении 180 вольт в течение 50 минут. Закрасьте гель гелем с нуклеиновой кислотой, защищенным от света на пять минут. С помощью трансиллюминатора синего света иссекаем полосу вокруг 128 нуклеотидов и выше.

Заморозьте кусочки полиакриламидного геля при температуре минус 80 градусов Цельсия не менее чем на 10 минут перед извлечением ДНК из полиакриламидного геля. Чтобы циркулировать ДНК, ресуспендируйте каждую гранулу ДНК в 16,75 микролитрах воды, не содержащей нуклеаз. Добавьте два микролитра 10-кратного одноцепочечного буфера ДНК-лигазы, один микролитр 50 миллимолярного хлорида марганца и 0,25 микролитра одноцепочечной ДНК-лигазы.

Инкубируйте при температуре 60 градусов Цельсия в течение одного часа, а затем при температуре 80 градусов Цельсия в течение 10 минут. Не выпаивая в осадок, храните продукт реакции одноцепочечного лигирования ДНК при температуре минус 20 градусов Цельсия. Затем проводят амплификацию библиотеки ПЦР с последующим количественным определением библиотеки и высокопроизводительным секвенированием, как описано в текстовом протоколе.

Приведены репрезентативные профили биоанализатора библиотеки амплифицированного отпечатка ПЦР и библиотеки секвенирования, полученных для образцов мРНК. Ожидаемый средний размер библиотеки отпечатков составляет от 148 до 152 нуклеотидов, а ожидаемый размер библиотеки мРНК — от 170 до 190 нуклеотидов. На этом графике показано общее количество прочтений мРНК, следа и рРНК, полученных для двух независимых биологических репликатов образца дикого типа и мутанта делеции hbs1.

От 50% до 60% всех секвенированных операций чтения в библиотеках посадочных мест соответствовали фрагментам посадочных мест, защищенным рибосомами. Напротив, только 3% фрагментов рРНК наблюдались в библиотеках мРНК, что свидетельствует о том, что выделение поли(А)мРНК позволяет эффективно устранять прочтения рРНК. Библиотеки образцов отпечатков и мРНК демонстрируют хорошую воспроизводимость, о чем свидетельствует коэффициент корреляции Пирсона, равный примерно 0,99 между совпадающими образцами.

В сочетании с измерениями численности мРНК профилирование рибосом позволяет измерить изменения эффективности трансляции между экспериментальными условиями. Значительно повышенные и пониженные регуляции гены в мутанте делеции hbs1 группируются в зависимости от того, влияют ли на них изменения в транскрипции мРНК, эффективности трансляции или общий эффект. После освоения весь протокол может быть выполнен примерно за 11 дней.

При выполнении этой процедуры важно не забывать надевать перчатки и выполнять все этапы с использованием реагентов и расходных материалов, не содержащих РНКазы, чтобы избежать загрязнения РНКазой и снизить риск деградации РНК в образцах. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как генерировать следы рибосом с помощью расщепления нуклеазы, выделять неповрежденные комплексы следов рибосом методом фракционирования сахарозы и готовить библиотеки ДНК для глубокого секвенирования. Не забывайте, что работа с жидким азотом может быть чрезвычайно опасной, поэтому при работе с очень холодными материалами всегда следует соблюдать меры предосторожности, такие как ношение защитных очков и криоперчаток.