Функциональные изображений вирусных транскрипции заводов с использованием 3D флуоресцентной микроскопии

Общая цель объединения зарождающейся РНК-FISH с аминоокрашиванием вирусных латентных белков состоит в том, чтобы визуализировать активную транскрипцию в сочетании с формированием вирусной фабрики транскрипции. Этот метод может быть использован для ответа на ключевые вопросы в области генетики, клеточной биологии, вирусологии и вирусологии клеточной биологии. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он использует индуцируемую вирусную мини-хромосомную модель для изучения молекулярных деталей, стоящих за геномными архитектурными изменениями.

Соберите клетки в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Центрифугируйте ячейки в течение двух минут под действием силы тяжести 200 вольт. Промойте клетки трижды одним миллилитром стерильного DEPC PBS.

Далее повторно суспендируйте клетки в 1,2 миллилитрах DEPC PBS. Поместите крышки на дно шестилуночной пластины. Пипеткой нанесите 200 микролитров смеси DEPC PBS на каждую крышку.

После того, как клетки отстоят в течение двух минут, отсасывайте избыток DEPC PBS, оставляя только тонкий слой клеток. Осторожно добавьте по одному миллилитру фиксирующего раствора на каждую крышку. Дайте ячейкам закрепиться в течение 10 минут.

Промойте крышку крышки три раза с помощью DEPC PBS. После промывки осторожно добавьте один миллилитр глицина DEPC PBS до конечной концентрации глицина 100 миллимоляров на каждый покровный листок. Дайте клеткам остыть в течение пяти минут.

Добавьте 1,5 миллилитра DEPC PBS и поставьте на шейкер на пять минут, а затем крепко, но осторожно встряхните в руке в течение одной минуты. Аспирируйте избыток DEPC PBS и будьте осторожны, чтобы не нарушить работу клеток. Осторожно добавьте по одному миллилитру проникающего раствора на каждую крышку.

Дайте клеткам проникнуть в течение 15 минут. Добавьте 1,5 миллилитра DEPC PBS. Поместите ячейки на шейкер на пять минут и крепко, но осторожно встряхивайте в руке в течение одной минуты.

Аспирируйте избыток DEPC PBS и будьте осторожны, чтобы не нарушить работу клеток. Пометьте предметные стекла микроскопа и смочите бумажное полотенце, затем выстелите дно герметичного пластикового контейнера полотенцем. Далее приготовьте первичный раствор антитела и умножьте рецепт на каждый покровный листок в наличии.

Поместите 30 микролитров раствора первичного антитела на каждое меченое предметное стекло микроскопа. Убедитесь, что концентрация первичного антитела правильная, удерживая уголок защитного колпачка и осторожно щелкнув им. Кроме того, уголок салфетки можно использовать для отвода лишней влаги.

Затем поместите защитный листок на маркированные предметные стекла микроскопа, стараясь не допустить образования пузырей. Накройте контейнер снаружи полиэтиленовой пленкой. Переместите контейнер в инкубатор, установленный на 37 градусов Цельсия, на один час.

Во время инкубации подготовьте необходимые реагенты. После инкубации промойте клетки трижды с помощью DEPC PBS в шестилуночном планшете по пять минут каждая. Затем промойте ячейки с помощью буфера для промывки FISH три раза по пять минут каждая.

И держите крышку в буфере для промывки FISH до тех пор, пока не будет приготовлено вторичное антитело, смесь интронного зонда. Далее очистите стекла для первичной инкубации антител для гибридизации мыльным раствором. После того как они высохнут, промойте их этанолом и салфеткой.

Поместите 40 микролитров вторичного антитела и интронный зонд FISH с раствором на каждое предметное стекло. Поместите крышки с ячейками на предметные стекла стороной вниз на верхнюю часть буфера. И будьте осторожны, чтобы не занести пузыри.

Поместите горки в пластиковый контейнер с влажным бумажным полотенцем на дне. Заверните пластиковый контейнер сначала в пищевую пленку, а затем в алюминиевую фольгу. И инкубируйте емкость с горками.

После инкубации осторожно сдвиньте крышку стекла с края предметного стекла и поместите его обратно в шестилуночные планшеты лицевой стороной вверх. Промойте ячейки буфером для промывки FISH три раза в шестилуночной пластине по пять минут каждая. Далее промойте клетки два раза двукратным ОСК.

Добавьте DAPI в концентрации от одного до 1000 в двукратный SSC и дайте раствору постоять пять минут при комнатной температуре. Дважды промойте клетки двукратным ССК. Очистите стеклянные предметные стекла, используемые для гибридизации, и добавьте 10 микролитров монтажного раствора на стеклянные стекла.

Положите защитные накладки лицевой стороной вниз на монтажный раствор. С помощью лабораторной салфетки аккуратно удалите излишки монтажного раствора, стараясь не раздавить клетки. Используя лак для ногтей, нанесите достаточный слой по краю покровных лоскутов и дайте лаку высохнуть.

Теперь образец готов к флуоресцентной микроскопии. Клетки BCBL-1 окрашивали на РНК LANA и K-Rta, чтобы изучить, где находятся активно транскрибирующие вирусные эписомы, а также гетерогенность ответа на вирус герпеса, ассоциированный с саркомой Капоши, или реактивационные стимулы KSHV. Отчетливая флуоресценция K-Rta в областях, которые близко соответствуют распределению вирусных эписом, свидетельствует о том, что активная транскрипция происходит вблизи геномов KSHV.

В том же образце можно наблюдать клетки, которые демонстрируют гораздо более слабую и диффузную флуоресценцию K-Rta, которая существенно не перекрывается с LANA, что иллюстрирует значительную вариабельность и степень реакции на стимулы реактивации в популяции клеток. Затем была изучена эффективность синхронизации тимидина путем визуализации экспрессии вирусного белка, которая ясно продемонстрировала, что синхронизированные клетки больше реагировали на стимулы реактивации, чем несинхронизированная популяция. Окрашивание DAPI может выполнять несколько функций, на этом примере наглядно видно, что вместо одной клетки есть три отдельные ячейки.

3D-микроскопия наряду с этим методом выявила кольцеобразные структуры РНК PII, видимые с геномами KSHV, разбросанными по периферии. С его разработкой мини-вирусная хромосома предоставит исследователям уникальные инструменты для изучения особой временной организации экспрессии генов и регрессии клеточного ядра.