Разработка в Vitro Assay чтобы Quantitate гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток (HSPCs) в развитии эмбрионов у рыбок данио

Общей целью данного анализа является перечисление и изучение дифференцировки гемопоэтических клеток-предшественников в развивающемся эмбрионе рыбки данио. Этот метод может помочь ответить на некоторые действительно важные вопросы в области кроветворения, такие как сколько стволовых и прогениторных клеток на самом деле находится в развивающемся эмбрионе данио-рерио. Основное преимущество этой техники заключается в том, что она быстрая, относительно недорогая и простая в исполнении.

Хотя этот метод может дать представление о количестве предшественников, присутствующих у развивающихся рыбок данио, он также позволяет исследователям измерить функциональное влияние, которое лекарство или генетическая мутация оказывают на образование предшественников в крови. Идея этого метода пришла к нам, когда мы уничтожали гены, которые, как мы предполагали, имели решающее значение для развития крови. Мы предположили, что с помощью этого анализа мы сможем измерить разницу между нормально развивающимися эмбрионами и теми, которые были морфантами.

Чтобы отбелить эмбрионы рыбок данио, используйте пластиковые контейнеры для создания трех моечных станций, одна из которых содержит один миллилитр пятипроцентного отбеливателя на один литр E3, а две станции содержат стерильный E3. С помощью пипетки для переноса поместите эмбрионы в ситечко для чая и погрузите их в промывочную станцию номер один на пять минут. Затем переложите чайное ситечко с зародышами в промывочную станцию номер два на пять минут. Повторите для моечной станции номер три в течение последних пяти минут.

После последней промывки извлеките эмбрионы из ситечка для чая, перевернув его вверх дном над чистой 10-сантиметровой чашкой Петри, и с помощью переводной пипетки и стерильного E3 аккуратно смойте эмбрионы с ситечка. Чтобы дехорионировать эмбрионы, используйте трансферную пипетку, чтобы удалить и отбросить как можно больше E3 из чашки Петри. Затем добавьте к эмбрионам 500 микролитров дехорионационных продеас и инкубируйте их при комнатной температуре в течение пяти минут.

Далее аккуратно постучите по стенке чашки Петри, чтобы полностью удалить хорионы. Затем с помощью серологической пипетки добавьте 20 миллилитров стерильного Е3, чтобы развести продеас. Дайте эмбрионам осесть и удалите E3 с помощью пипетки. Повторите этот шаг промывки три раза, чтобы удалить все следы дехорионационных продеасов.

Чтобы подготовить образцы эмбрионов, с помощью пипетки поместите 10 эмбрионов в одну стерильную микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров. Затем осторожно извлеките E3 из пипетки и выбросьте ее. Перенесите образцы в колпак с ламинарным потоком и промойте эмбрионы, добавив один миллилитр стерильного Е3, что позволит эмбрионам осесть на дно пробирки.

Затем с помощью пипетки P1000 удалите надосадочную жидкость. Повторите в общей сложности три мытья. После последней стирки извлеките E3 и выбросьте его.

Затем добавьте один миллилитр 10 миллимолярного DTT в E3, чтобы удалить слизистый слой и любые споры, дрожжи или бактерии, которые могут быть в нем вокруг эмбрионов. Теперь положите микроцентрифужную трубку горизонтально и инкубируйте ее при комнатной температуре в течение 25 минут. Чтобы диссоциировать эмбрионы, используйте один миллилитр стерильного DPBS, чтобы трижды промыть образец.

После последней промывки добавьте 500 микролитров DPBS с кальцием и магнием и пять микролитров по пять миллиграмм на миллилитр диссоциационных продей. Инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия на горизонтальном орбитальном вибростенде со скоростью 180 об/мин в течение 60 минут. Затем поместите образцы и ламинарный проточный колпак и с помощью P1000 растирайте эмбрионы до тех пор, пока образцы полностью не диссоциируют.

Будьте осторожны и периодически проверяйте эмбрионы, чтобы определить, когда они диссоциированы. Вам нужно, чтобы присутствовало некоторое количество ткани. Эмбрионы могут перевариться, что приведет к уничтожению клеток-предшественников.

Нанесите пипеткой 10 диссоциированных эмбрионов в верхний резервуар пятимиллилитровой полистирольной пробирки с круглым дном и крышкой сетчатого фильтра 35 микрометров. С помощью пипетки и стерильного PBS промойте пробирку эмбриона и перенесите раствор в пятимиллилитровую полистирольную пробирку, содержащую отфильтрованные клетки. Повторяйте полоскание до тех пор, пока в тюбике не появится четыре миллилитра жидкости.

Центрифугируйте пробирки при температуре, в 300 раз превышающей гравитацию, и четырех градусах Цельсия в течение пяти минут, чтобы подтянуть гомогенизированный образец клетки. С помощью пипетки извлеките и выбросьте надосадочную жидкость из пробирки с круглым дном, стараясь не нарушить клетки, гранулированные на дне. Затем используйте 100 микролитров PBS для повторного суспендирования клеток.

Приготовьте один полный раствор метилцеллюлозы и с помощью трех миллилитровых шприцев и 16 игл калибра добавьте 2,5 миллилитра стерильных 14-миллилитровых пробирок с круглым дном. Используйте одну пробирку для каждого тестируемого состояния. Для миелоидной дифференцировки добавьте в среду метилцеллюлозы 1% сыворотки карпа и 0,3 мг на миллилитр рекомбинантного гранулоцитарного колониестимулирующего фактора данио-рерио или GCSF.

Для дифференцировки эритроидов добавьте в среду метилцеллюлозы один процент сыворотки карпа и 0,1 миллиграмма на миллилитр рекомбинантного эритропоэтина данио-рерио или ЭПО. Для изучения многолинейных прародителей добавьте ЭПО и ГКСФ. С помощью пипетки добавьте 100 микролитров из 10 диссоциированных эмбрионов на поверхность приготовленной метилцеллюлозы с рекомбинантными цитокинами в сыворотке крови карпа.

Закройте крышку и аккуратно встряхните образец, чтобы полностью гомогенизировать образец. Теперь каждая пробирка должна содержать диссоциированную ткань 10 эмбрионов. С помощью трех миллилитровых шприцев и 16 измерительных игл распределите один миллилитр образца в две отдельные 35-миллиметровые чашки Петри.

Убедитесь, что образец полностью рассредоточен по всей чашке Петри. Повторите для каждого образца. Поместите 35-миллиметровые чашки Петри с ячейками и метилцеллюлозой в 15-сантиметровую чашку Петри.

К каждой большой тарелке добавьте одну 35-миллиметровую посуду с пятью миллилитрами стерильной воды для увлажнения образцов. Инкубируйте посуду при температуре 32 градуса Цельсия и пяти процентах углекислого газа в течение 7-10 дней. Наконец, визуализируйте блоки, образующие колонии, в соответствии с текстовым протоколом.

После семи дней культивирования с опорными факторами кроветворения были подсчитаны и визуализированы предшественники 48 эмбриональных рыбок данио-рерио HPF. Важно отметить, что количество используемого КФ напрямую коррелирует с количеством эмбрионов. Осаждение четырех или восьми эмбрионов на миллилитр, что соответствует началу с 10 или 20 эмбрионов, в начале эксперимента дает примерно 1200 или 2400 КОЕ соответственно.

После освоения этой техники ее можно выполнить за два с половиной часа, если она выполнена правильно. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить, что нельзя переваривать эмбрионы, так как это приведет к уничтожению клеток-предшественников. С помощью этой процедуры вы можете сравнить количество прародителей, присутствующих в разные моменты времени.

Можно сравнить мутантных животных с животными дикого типа, а также проверить влияние лекарственных препаратов на развитие крови. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить анализ на метилцеллюлозу для перечисления гемопоэтических предшественников рыбок данио. Вы можете изменить эту процедуру в соответствии с вашими конкретными экспериментальными потребностями, например, проверить определенные цитокины.

Не забывайте, что работа с кровью и иглами позвоночных может быть чрезвычайно опасной, и при выполнении этого анализа всегда следует соблюдать осторожность.