Надежные ДНК изоляции и высокопроизводительного секвенирования строительство библиотеки для образцов гербария

Общая цель этого протокола заключается в увеличении количества выделенной двухцепочечной ДНК и последующих высокопроизводительных библиотек секвенирования из гербарных образцов, максимизируя их полезность в филогеномных исследованиях. Этот метод раскрывает потенциал гербарных образцов, которые в противном случае не были бы полезны для проектов секвенирования в качестве геномных последовательностей из-за обширной деградации образцов. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он достаточно надежен, чтобы можно было использовать редкие и исторически значимые гербарные образцы без необходимости обширного разрушительного отбора проб.

Этот метод увеличивает глубину выборки таксонов в проектах с систематическим интервалом. Приобретение видов является ограничивающим шагом, но с помощью этого протокола исторические коллекции могут быть легко использованы в этих исследованиях. Добавьте жидкий азот и от 30 до 50 миллиграммов стерилизованного песка, чтобы измельчить один квадратный сантиметр предварительно выбранной гербарной ткани в мелкий порошок в предварительно охлажденной ступке и пестиком.

Адекватное измельчение имеет важное значение для успешной изоляции ДНК. И следует следить за тем, чтобы проба была полностью измельчена. Далее добавьте замороженный порошок в две двухмиллилитровые трубки, заполнив не более половины объема трубки.

Затем добавьте в каждую пробирку по 600 микролитров теплого раствора CTAB. Тщательно перемешайте порошок путем инвертирования и вортекса. Затем инкубируйте образцы на водяной бане при температуре 65 градусов Цельсия в течение от одного до 1,5 часов.

Тем временем делайте вихри каждые 15 минут. Затем центрифугируйте образцы при 10 000 г в течение пяти минут при комнатной температуре. После центрифугирования перелейте примерно 500 микролитров надосадочной жидкости в новый, свежий набор пробирок с маркировкой.

К надосадочной жидкости добавьте четыре микролитра по 10 миллиграмм на миллилитр РНКазы А в каждую мелодию. Затем перемешайте содержимое пробирки путем переворачивания или пипетирования. Инкубируйте образцы в тепловом блоке или водяной бане при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Как только пробирки нагреются до комнатной температуры, добавьте в образцы примерно 500 микролитров смеси фенола, хлороформа, изоамилового спирта 25:24:1. Затем перемешайте содержимое пробирок путем инвертирования или повторного пипетирования. Затем центрифугируют образцы при 12 000 г в течение 15 минут при комнатной температуре.

Верхний водный слой, который составляет примерно 400 микролитров, переложите в свежий набор промаркированных туб. В водный слой в каждую пробирку добавьте примерно 400 микролитров смеси хлороформа 24:1, изоамилового спирта. Тщательно перемешайте образец путем повторного пипетирования или инверсии.

Затем центрифугируйте пробирки при 12 000 г в течение пяти минут и перенесите примерно 300 микролитров верхнего водного слоя в предварительно охлажденные, помеченные пробирки. Далее добавьте 300 микролитров предварительно охлажденного изопропанола и 12 микролитров 2,5 моляра ацетата натрия. Затем инкубируйте пробирки при температуре минус 20 градусов Цельсия в течение 30-60 минут.

После инкубации достаньте образцы из морозилки. Далее центрифугируйте образцы при 12 000 г в течение 15 минут при комнатной температуре. После центрифугирования промойте гранулу примерно 300-500 микролитрами 70% этанола.

Снова центрифугируйте пробирки при 12 000 г в течение 10 минут. Затем, не потревожив гранулу, аккуратно удалите надосадочную жидкость. Затем высушите гранулы на воздухе и растворите ДНК в 50 микролитрах буфера 1X Tris-EDTA.

Добавьте от одного до 16 микролитров выделенной ДНК и два микролитра буфера для реакции фрагментации в 0,2-миллилитровую полимеразную цепную реакционную пробирку. Отрегулируйте итоговый объем до 18 микролитров с помощью воды, не содержащей нуклеаз. Затем добавьте два микролитра двухцепочечного фермента фрагментации ДНК и кратковременно перемешайте смесь в течение трех секунд.

Затем инкубируйте образцы при температуре 37 градусов Цельсия в течение 8,5 минут в термоамплификаторе. После инкубации добавьте в пробирки пять микролитров 0,5 моляра ЭДТА. Добавьте 25 микролитров воды, не содержащей нуклеаз, чтобы довести общий объем срезанной ДНК до 50 микролитров.

Затем добавьте 45 микролитров гранул SPRI, поддерживаемых при комнатной температуре, к 50 микролитрам срезанной ДНК и тщательно перемешайте их, пипетируя вверх и вниз. Оставьте образец с пробирками на пять минут. Затем переложите трубки на магнитную пластину и подождите еще пять минут.

Осторожно изгоните надосадочную жидкость. Далее добавьте в пробирки на магнитной подставке 200 микролитров свежего 80%-ного этанола и подождите еще 30 секунд при комнатной температуре. Через 30 секунд осторожно удалите надосадочную жидкость.

Оставьте крышку тубы открытой, чтобы высушить шарики на воздухе в течение пяти минут на магнитной подставке. Затем снимите пробирки с магнитной подставки и вымывайте ДНК из бусин в 55 микролитрах 0,1X Tris-EDTA буфера. Тщательно перемешайте ДНК путем повторного пипетирования.

Затем инкубируйте образец при комнатной температуре в течение пяти минут. Снова поместите трубку на магнитную подставку и подождите, пока раствор исчезнет примерно через две минуты. Удалите 52 микролитра надосадочной жидкости, а затем выполните количественный анализ ДНК, как указано в текстовом протоколе.

К 50 микролитрам очищенной и срезанной ДНК добавьте три микролитра эндонуклеазы, фосфатные ферменты хвостоудаления и семь микролитров реакционного буфера. Тщательно перемешайте ДНК и другие компоненты, пипетируя вверх и вниз. Затем закрутите трубочки, чтобы удалить пузырьки.

После отжима перенесите образцы в термоамплификатор и установите программу. Разбавьте адаптер в 25-50 раз, чтобы достичь рабочей концентрации от 0,6 до 0,3 микромоляра. Для высокопроизводительного секвенирования с коротким чтением добавьте в пробирки 30 микролитров мастер-смеси для лигирования, один микролитр усилителя лигирования и 2,5 микролитра адаптера.

Тщательно перемешайте содержимое пробирок пипеткой вверх и вниз. Снова закрутите трубки, чтобы удалить любые пузыри. Затем инкубируйте пробирку при температуре 20 градусов Цельсия в течение 15 минут.

Добавьте в пробирки три микролитра покупной смеси урацил-ДНК гликозилазы и ДНК-гликозилазы лиазы эндонуклеазы VIII. Отрегулируйте общий объем до 96,5 микролитров. Тщательно перемешайте компоненты и выдержите при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут в термоамплификаторе.

В пробирке приготовьте смесь полимеразной цепной реакции, добавив все реагенты к очищенной, лигированной адаптором ДНК. Затем хорошо перемешайте реакцию вортексом. Как только вихрь закончится, поместите образцы в амплификатор и запустите настройку амплификации термоамплификатора.

Добавьте в образец около 25 микролитров магнитных шариков, поддерживаемых при комнатной температуре, и перемешайте путем повторного пипетирования. Инкубируйте образец в течение пяти минут. Затем переложите трубки на магнитную подставку и подождите еще пять минут.

Через пять минут удалите надосадочную жидкость в новый набор пробирок с маркировкой. Далее в надосадочную жидкость добавьте шесть микролитров шариков SPRI, выдержанных при комнатной температуре, и тщательно перемешайте. После инкубации образцов в течение пяти минут перенесите пробирки на магнитную пластину и подождите еще пять минут.

Удалите и выбросьте надосадочную жидкость. Затем добавьте 200 микролитров свежего 80%-ного этанола в пробирки на магнитной подставке. Далее инкубируйте пробирки при комнатной температуре в течение 30 секунд.

Через 30 секунд осторожно извлеките надосадочную жидкость и высушите шарики на воздухе в течение пяти минут при открытой крышке пробирки, все еще находясь на магнитной подставке. Теперь снимите трубки с магнита. Выделите целевую ДНК из шариков в 33 микролитра 0,1X Tris-EDTA буфера и подвергните тщательному перемешиванию.

После правильного перемешивания выдерживать при комнатной температуре в течение пяти минут. Затем перенесите пробирки на магнитную подставку и подождите около двух минут, пока раствор не станет прозрачным. Пипетка 30 микролитров надосадочной жидкости в двухмиллилитровые пробирки для хранения.

Чтобы показать выделение гербарной ДНК, был введен агарозный гель с двухцепочечной ДНК, выделенной из различных гербарных образцов. Используя 10 миллиграммов ткани листа, почти от 3,56 до 2,610 нанограммов выделенной двухцепочечной ДНК было загружено в агарозный гель. Гель показывает деградированную гербарную ДНК в виде мазка по всем дорожкам.

Затем, чтобы показать восстановление высококачественной библиотеки секвенирования из ДНК, выделенной из 10 гербарных образцов, был запущен агарозный гель. Перед загрузкой агарозного геля примерно от 1,26 до 464 нанограммов выделенной гербарной ДНК подвергали ферментативному сдвигу и очистке с объемом 90% гранул. Агарозный гель демонстрирует восстановление высококачественной библиотеки секвенирования из ДНК 10 гербарных образцов.

Окончательные библиотеки секвенирования показывают первичную полосу от 300 до 500 пар оснований. Затем, чтобы показать последовательность ДНК, полученной из гербария, был получен круговой график генома хлоропласта TK 686. Последовательность показывает общую длину ДНК, область инвертированных повторов и наличие больших и малых областей с одной копией.

После освоения эта техника может быть выполнена на 24 образцах менее чем за 13 часов, имея всего около восьми часов активного практического времени. После этой процедуры на полученных библиотеках могут быть применены другие методы, такие как захват последовательностей, для получения ядерных данных для филогенетических исследований.