Обогащение бактериальных липопротеинов и подготовка N-терминальный Lipopeptides структурные определения по масс-спектрометрии

Обогащение бактериальной липопротеинов с использованием фазы неионных ПАВ, секционирование метод описан для прямого использования в TLR анализов или других приложений. Дальнейшие шаги подробно подготовить tryptic lipopeptides N-терминала для структурных характеристик по масс-спектрометрии.

Общей целью этой процедуры является извлечение липопротеинов из бактериальных клеток для непосредственного применения и дальнейшая подготовка N-концевых липопептидов для структурного анализа с помощью масс-спектрометрии MALDI-TOF. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области иммунологии, поскольку N-концевая структура липопротеинов влияет на распознавание и передачу сигналов Toll-подобных рецепторов, влияя на иммунный ответ хозяина. Уникальным преимуществом этого метода является необязательное, но преднамеренное образование аддуктов натрия, что способствует фрагментации в направлении диагностического дегидроаланил-иона, способствуя структурному назначению состояния ацилирования липопротеина.

Выращивайте бактерии в 15 миллилитрах триптического соевого бульона или аналогичной насыщенной среды до поздней экспоненциальной фазы. Соберите клетки центрифугированием перед однократной промывкой с помощью трис-буферизованного физиологического раствора ЭДТА или TBSE. ресуспендировать клетки в 800 микролитрах TBSE с одним миллимолярным PMSF и 0,5 мг на миллилитр лизоцима.

Перелейте раствор в микроцентрифужную трубку объемом 2,0 миллилитра с резьбой с завинчивающейся крышкой и уплотнительным кольцом перед инкубацией в течение 20 минут при температуре 37 градусов Цельсия. Добавьте в пробирку примерно 800 микролитров 0,1-миллиметровых гранул диоксида циркония и диоксида циркония, затем нарушите работу клеток, встряхивая на максимальной скорости на гомогенизаторе в течение пяти циклов по 30 секунд каждый с двухминутным отдыхом на льду между каждым циклом. Центрифугируйте образец при 3000 умноженных на g в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия для гранулирования гранул и неповрежденных клеток.

Перенесите надосадочную жидкость в новую микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 миллилитров, затем держите на льду. Добавьте 200 микролитров TBSE к оставшимся гранулам и верните в гомогенизатор для дополнительного цикла. Центрифугируйте как и раньше и соедините надосадочную жидкость с предыдущей надосадочной жидкостью.

Дополните надосадочную жидкость поверхностно-активным веществом TX-114 до конечной концентрации 2%, добавив равный объем 4% поверхностно-активного вещества в ледяной TBSE. Инкубируйте добавленную надосадочную жидкость на льду в течение одного часа, перемешивая путем инверсии каждые 15 минут. Перенесите трубку на водяную баню с температурой 37 градусов Цельсия и инкубируйте в течение 10 минут, чтобы вызвать разделение фаз.

Центрифугируйте образец при 10 000 раз g в течение 10 минут при комнатной температуре, чтобы сохранить двухфазное разделение. Аккуратно отпижите верхнюю водную фазу и выбросьте. Добавьте ледяной TBSE в нижнюю фазу поверхностно-активного вещества, чтобы наполнить пробирку до исходного объема и перемешать.

Выдерживать на льду в течение 10 минут. После инкубации поместите пробирку на водяную баню при температуре 37 градусов Цельсия и инкубируйте в течение 10 минут, чтобы вызвать разделение фаз, затем центрифугируйте при 10 000 g в течение 10 минут при комнатной температуре. Повторив эти шаги еще раз в общей сложности три разделения, удалите верхнюю водную фазу и выбросьте.

Удалите гранулы осажденных белков, образовавшихся в ходе экстракции, добавив один объем ледяного TBSE в фазу поверхностно-активного вещества. Центрифугируйте при четырех градусах Цельсия и 16 000 г в течение двух минут, чтобы измельчить нерастворимый белок. Немедленно переложите надосадочную жидкость в свежую микроцентрифужную пробирку объемом 2,0 миллилитров, содержащую 1 250 микролитров 100% ацетона.

Перемешайте образец методом инверсии и инкубируйте в течение ночи при температуре минус 20 градусов Цельсия до осаждения белка. На следующий день центрифугируйте образец при 16 000 раз g в течение 20 минут при комнатной температуре, чтобы гранулировать липопротеины с вниманием к ориентации пробирки. Дважды промойте гранулу со 100% ацетоном перед сцеживанием ацетона и данием образцу высохнуть на воздухе.

Затем добавьте от 20 до 40 микролитров 10-миллимолярного Tris-HCL, pH 8,0, и тщательно ресуспендируйте гранулу путем пипетирования вверх и вниз у стенки с осажденными липопротеинами. Отделите липопротеины с помощью SDS-PAGE с помощью стандартных методов. Перенесите липопротеины на нитроцеллюлозную транспортную мембрану с помощью стандартной процедуры электроблоттинга.

Переложите нитроцеллюлозную мембрану в емкость и накройте раствором Ponceau S. Осторожно покачивайте в течение пяти минут или пока не станут видны красно-розовые полосы. Слейте раствор Ponceau S и тщательно промойте нитроцеллюлозную мембрану дистиллированной водой, чтобы удалить излишки пятна.

Чистым лезвием бритвы вырежьте нужную ленту и переложите в микроцентрифужную пробирку. Промойте мембрану три раза одним миллилитром дистиллированной воды, чтобы полностью очистить ленту от пятен. Перенеся срез на чистую поверхность, с помощью чистого лезвия бритвы нарежьте полоску нитроцеллюлозы небольшими кусочками размером примерно один миллиметр на один миллиметр.

Соберите кусочки в микроцентрифужную пробирку объемом 0,5 миллилитра с низким связыванием белка. Наконец, дважды промойте кусочки 500 микролитрами свежеприготовленного 50-миллимолярного бикарбоната аммония с pH 7,8 в воде для ВЭЖХ. Ресуспендируйте кусочки нитроцеллюлозы в 20 микролитрах 20 микрограмм на миллилитр раствора трипсина в 50-миллимолярном бикарбонате аммония.

Вихревыми перебейте ресуспендированные кусочки нитроцеллюлозы перемешать. Затем коротко поверните трубку, чтобы убедиться, что все детали полностью покрыты раствором трипсина. Накройте крышку пробирки парафиновой пленкой, чтобы предотвратить испарение, и выдержите дижест в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.

Вращайте образец со скоростью 16 000 г в течение 30 секунд и удалите жидкость с помощью пипетирования. Затем добавьте 50 микролитров 0,5% трифторуксусной кислоты в воду класса ВЭЖХ. После вортексирования для смешивания кратковременно поверните образец, чтобы убедиться, что все кусочки покрыты раствором, и инкубируйте образец в течение 10 минут при комнатной температуре.

После удаления жидкости с помощью пипетирования повторите этот шаг с 50 микролитрами 10% ацетонитрила, а затем повторите еще раз с 50 микролитрами 20% ацетонитрила. Чтобы разбавить плотно связанные липопептиды, добавьте 15 микролитров свежеприготовленной матрицы CHCA 10 мг на миллилитр, растворенной в хлороформе-метаноле. Выдерживать в течение 10 минут при комнатной температуре с прерывистым вортексированием.

Чтобы стимулировать образование аддуктов натрия, добавьте в раствор CHCA в хлороформ-метаноле водный бикарбонат натрия до конечной концентрации одного миллимолара. После краткого вращения образца с помощью пипетки осторожно переложите жидкость в новую микроцентрифужную пробирку с низким связыванием белка. Этот раствор будет содержать основную массу N-концевых липопептидов.

Нанесите один микролитр элюированных липопептидов с CHCA на мишень MALDI из полированной стали. Сразу приступаем к масс-спектрометрии. Здесь приведены примеры масс-спектров ступенчатых растворов нитроцеллюлозы липопротеина PnrA энтерококка faecalis.

С каждой последующей промывкой наблюдаются изменения интенсивности сигнала и уменьшение отдельных пиков, кульминацией которых является высокообогащенный N-концевой ион липопептида в конечной фракции элюирования. Спектр МС/МС исходного иона липопептида показывает, что он является лизоформом с фрагментами ионов, соответствующими N-концевому триптидному пептиду PnrA, имеющему альфа-аминосвязанную ациловую цепь и моноацилглицериновую структуру. Добавление бикарбоната натрия к элюированной липопептидной фракции липопротеина Escherichia coli Lpp приводит к увеличению 22-Дальтона от расчетной N-концевой массы.

Анализ МС/МС исходного иона по сравнению с его аддуктом натрия демонстрирует преимущественную фрагментацию в сторону дегидроаланиль-иона содированного родителя за счет нейтральной элиминации диако тиоглицерильной части. Это помогает в структурном определении N-концевого состояния ацилирования. При проведении этой процедуры стоит помнить, что каждая ступенчатая фракция промывки нитроцеллюлозы может быть проанализирована с помощью масс-спектрометрии, что позволяет как идентифицировать белок, так и N-концевую характеристику липопептида в одном эксперименте.

После экстракции липопротеинов из бактерий могут быть проведены другие эксперименты, такие как клеточные анализы, измеряющие передачу сигналов Toll-подобных рецепторов, чтобы ответить на дополнительные вопросы, например, как состояние ацилирования липопротеинов влияет на иммунный ответ хозяина.