Метаболические карт: Количественные фермента цитохимии и гистохимии для определения активности дегидрогеназ в клетках и тканях

В этом видео показано, как выполнить метаболическое картирование. Процедура количественной оценки активности конкретных ферментов, называемых дегидрогеназами. Клетки прилипают к предметному стеклу или замороженной ткани.

Несколько десятилетий назад мы разработали целый ряд методов метаболического картирования, которые тогда назывались энзимохимией, для обнаружения активности в тканях и клетках под микроскопом. Однако метаболизм устарел во время генетической революции в конце прошлого века. Но теперь обмен веществ снова горячий.

Посмотрите, например, на раковые клетки. Метаболизм в настоящее время считается терапевтической мишенью, и поэтому определение активности в клетках и тканях снова стало горячим. Ключевым компонентом реакционного буфера является поливиниловый спирт, или ПВС.

Это растворенный в фосфате буфер в концентрации 18% ПВА является пыльным и токсичным при вдыхании, поэтому обязательно взвешивайте ПВА под вытяжным шкафом. Из-за высокой концентрации ПВС в фосфатном буфере нагрейте бутылку с реакционным буфером на водяной бане, помешивая. Обязательно плотно закрутите крышку на бутылке, иначе бутылка может взорваться.

Может пройти до 15 минут, прежде чем ПВС полностью растворится в фосфатном буфере. Если это так, то раствор должен быть прозрачным с небольшими пузырьками воздуха, которые образовались в результате перемешивания. Вязкий раствор ПВС можно дозировать в реакционные буферные пробирки с помощью широкой пипетки.

Держите трубки при температуре не менее 40 градусов по Цельсию или выше, чтобы предотвратить затвердевание ПВА. Одного миллилитра раствора ПВА достаточно примерно для четырех цитоспинов, или двух тканевых препаратов. Что касается других компонентов реакционного буфера, то желтый нитрозий тетразолия хлорид, также называемый nitroBT, растворяют в смеси этанола и диметилформамида, нагревая его в стеклянном флаконе в горелке Бунзена.

Раствор не должен дойти до кипения, иначе объем уменьшится слишком сильно. Поэтому не оставляйте флакон слишком долго в огне и регулярно встряхивайте. Держите его на льду после растворения и быстро переходите к следующему этапу, так как растворенный nitroBT быстро погибает.

NitroBT — это желтый порошок, который будет лежать на дне стеклянного флакона, содержащего этанол и ДМФУ, если его не растворить. Вы можете проверять каждые несколько раз, растворен ли nitroBT. Раствор будет желтым прозрачным.

После растворения nitroBT можно дозировать во флаконах, содержащих раствор ПВА. Осторожно перемешайте тонкой ложкой или тонким шпателем, чтобы смешать nitroBT и буфер. Проделайте это пошагово для всех компонентов реакционного буфера, которые перечислены в таблице 1 полного текста.

Старайтесь не создавать слишком много пузырьков воздуха при перемешивании компонентов реакции в растворе ПВА. Хитрость заключается в том, чтобы постоянно помешивать, не вынимая ложку или шпатель из раствора. Переносчик электронов, метоксифеназиний метилсульфат, должен быть защищен от света и растворен в реакционном буфере в последнюю очередь.

Красный цвет MPMS удобен для перепроверки, все ли компоненты растворены правильно. Во время приготовления реакционного буфера и перемешивания в нем компонентов, предварительно прогрейте предметные стекла в течение 50 минут в инкубаторе, содержащем теплую воду. Поддерживайте низкий уровень воды внутри инкубационной камеры.

При закрытой крышке это позволит сохранить среду реакции влажной. При открытой крышке вода будет поддерживать теплую температуру горки. Нанесите реакционный буфер на клеточные или тканевые препараты с помощью стеклянной пипетки.

Не беспокойтесь о мелких пузырьках воздуха, потому что они будут поступать на поверхность и не будут мешать реакции в клетках или тканях. В течение всего времени инкубации крышка инкубационной камеры должна быть закрыта. Это гарантирует, что реакция будет происходить во влажной среде, чтобы предотвратить высыхание буфера ПВА.

Большинство реакций дегидрогеназы в экспериментах по метаболическому картированию происходят при температуре 37 градусов по Цельсию. Инкубируйте слайды в реакционном буфере в течение заданного количества времени, которое можно найти в таблице 1 полного текста статьи. Можно легко увидеть, протекала ли реакция, поскольку клетки или ткани становятся темно-синими или фиолетовыми из-за активности дегидрогеназ.

Который в конечном итоге превращается в бесцветный нерастворимый нитроВТ в темно-синий формазол, который выпадает в осадок в месте активности дегидрогеназы. Ферментативная реакция останавливается в три этапа. Во-первых, избыток инкубационной среды должен быть отброшен на ткань.

Во-вторых, инкубационная среда должна быть смыта со предметных стекол микроскопии с помощью механической промывки в фосфатном буфере PH 5,3 при 60 градусах Цельсия. В-третьих, предметные стекла для микроскопии должны быть оставлены в свежем фосфатном буфере PH 5,3 при температуре 60 градусов по Цельсию на 20 минут. В-четвертых, фосфатный буфер можно смыть с помощью водопроводной, а затем дистиллированной воды.

Хорошо видно, как отходит реакционный буфер. Низкий pH останавливающего буфера помогает остановить реакцию дегидрогеназы внутри клеток. Поместите слайды в буфер для свежей остановки один или два раза, в зависимости от того, сколько слайдов вы обрабатываете за раз.

Также промойте горки водопроводной водой и закончите дистиллированной водой. Теперь горки можно сушить на грелке для слайдов и закрывать в закрытом виде. Тщательно высушите заднюю сторону горки, протерев ее, и поместите на грелку для горки, разогретую до 50 – 60 градусов по Цельсию.

Когда слайды высохнут, можно использовать раствор глицерина и защитные стекла для закрытия и сохранения слайдов. Сохраните слайды в холодильнике до начала получения изображения. Это цветная фотомикрофотография репрезентативного среза ткани на предметном стекле, которая была обработана в эксперименте, показанном в этом видео.

Это участок глиобластомы, и лептодегидрогеназа является ферментом, который был исследован. Каждая дегидрогеназа продуцирует сущность PH, а каждая молекула PH превращает одну молекулу nitroBT, желтой соли тетразола, в одну молекулу формазола, фиолетового осадка, показанного на этом изображении. Высокая активность лактатдегидрогеназы внутриклеточно в опухолевых клетках обозначена темно-фиолетовым цветом.

Кровеносные сосуды имеют меньшую активность и имеют белый цвет. Это монохроматическое изображение одной и той же области слайда. Который может быть использован для количественной оценки активности фермента, как описано в протоколе.

Чем больше формазана, тем темнее пиксель, и тем выше поглощение. Затем поглощение может быть преобразовано в пикомоле сгенерированного объекта ph. Таким образом, метаболическое картирование легко выполнить.

Это очень быстро и дешево. Так что используйте его в своих исследованиях.