ТРИФОСФАТЫ/Cas9-опосредованной целенаправленной интеграции в естественных условиях с помощью стратегию на основе присоединения гомологии опосредованной конец
March 12th, 2018
Кластеризованный регулярно interspaced короткие палиндром повторяется/ТРИФОСФАТЫ связанные белком 9 (ТРИФОСФАТЫ/Cas9) система обеспечивает перспективным инструментом для генной инженерии и открывает возможность целенаправленной интеграции трансгенов. Мы описываем гомологии опосредованной конец присоединения (HMEJ)-на основе стратегии для эффективных ДНК интеграции в естественных условиях и целевой терапии гена с помощью ТРИФОСФАТЫ/Cas9.
Общая цель данной стратегии HMEJ заключается в том, чтобы предоставить многообещающий генетический инструмент для различных применений, включая создание генетически модифицированных животных моделей и таргетную генную терапию. Этот HMEJ принял эту меру. Может также иметь ключевые вопросы в генетической и нейрообласти.
Например, как повысить эффективность точной адресной интеграции трансгенов in vivo. Основным преимуществом этой стратегии, основанной на HMEJ, является возможность коррекции генных мутаций с высокой эффективностью in vivo. Который последовал за этим, является терапевтическим по потенциалу.
Демонстрировать процедуру будет Син Ван, аспирант из моей лаборатории. Чтобы начать работу с протоколом, соберите 5000 клеток N2a, ранее трансфицированных векторами экспрессии Cas9 sgRNA EGFP методом сортировки активированных флуоресцентных клеток или FACS, используя нетрансфицированные клетки в качестве контроля. Переварите собранные клетки в буфере для лизиса от 2 до 5 микролитров при температуре 56 градусов Цельсия в течение 30 минут.
Затем нагрейте и активируйте протеиназу К при температуре 95 градусов Цельсия в течение 10 минут. Амплифицируйте образец с помощью вложенной ПЦР в соответствии с протоколом производителя. Смешайте один микролитр продукта лизиса с ДНК-полимеразой и парой наружных праймеров, узнавающих последовательность вокруг сайта-мишени sgRNA и проведите первичную ПЦР в общем объеме 20 микролитров.
Далее активируйте ДНК-полимеразу при 95 градусах Цельсия в течение 5 минут, затем проведите первичную ПЦР с окончательным удлинением при 72 градусах Цельсия в течение 5 минут. Проведите вторичную ПЦР с использованием одного микролитра первичного продукта ПЦР и пары вложенных внутренних праймеров. Денатурировать и повторно обжечь 300-600 нанограмм очищенного продукта ПЦР в 20 микролитрах 1x реакционного буфера TC7EI.
Добавьте один микролитр фермента T7EI в отожженные продукты ПЦР и переваривайте их при 37 градусах Цельсия в течение двух часов. Затем запустите продукт пищеварения на 2% агарозном геле и 1x буфере TAE при напряжении 120 вольт в течение 40 минут, пока фрагменты не отделятся. Используйте ImageJ для определения интенсивностей полос разрезанной и неразрезанной ДНК и вычисления частоты инделя.
Для получения мРНК Cas9 добавьте последовательность промотора T7 в кодирующую область Cas9 путем амплификации ПЦР. Затем добавьте праймер Cas9 FR в конечной концентрации 0,1 микромоляра и 20 нанограммов экспрессирующего вектора Cas9 в смесь ДНК-полимеразы высокой точности 1x. Отрегулируйте итоговый объем до 50 микролитров с помощью воды, не содержащей нуклеазы.
Активируйте ДНК-полимеразу при температуре 95 градусов Цельсия в течение 5 минут и проведите ПЦР. Очистите T7 Cas9 и продукт ПЦР для транскрипции in vitro или IVT. Затем расшифруйте от 0,5 до 1 микрограмма ДНК, используя набор для транскрипции мРНК при температуре 37 градусов Цельсия в течение 8 часов в общем объеме 20 микролитров.
Добавьте в смесь 1 микролитр ДНКазы, чтобы удалить матрицу ДНК при температуре 37 градусов Цельсия на 15 минут. После добавления поли(А)хвоста в течение 45 минут при 37 градусах Цельсия восстановите мРНК Cas9 с помощью набора для очистки РНК. Сгенерируйте матрицу sgRNA, управляемую промотором T7 с высокоточной ДНК-полимеразой, как описано в предыдущем разделе, и выберите в качестве матрицы каркас sgRNA, содержащий вектор
.После очистки продукта ПЦР Т7 sgRNA используйте от 0,5 до 1 микрограмма ДНК в качестве матрицы для транскрипции sgРНК in vitro с использованием короткого набора для транскрипции РНК при температуре 37 градусов Цельсия в течение 6 часов, в общем объеме 20 микролитров. После 6 часов инкубации добавьте в смесь 1 микролитр ДНКазы и продолжайте инкубацию при температуре 37 градусов Цельсия в течение 15 минут, чтобы удалить шаблон ДНК. Снова очистите sgРНК с помощью набора для очистки РНК.
Разбавьте sgRNA до 500 нанограммов на микролитр в воде, свободной от РНКазы, и храните образцы при температуре минус 80 градусов Цельсия до трех месяцев. Высокое качество мРНК Cas9 и sgРНК без дегенерации и правильная линия донорских параметров HMEJ являются наиболее важными этапами в создании мышей с нокаутом. Оплодотворенные эмбрионы поместить в среду КСОМ при температуре 37 градусов Цельсия в инкубатор с 5% углекислым газом.
Смешайте 100 нанограмм на микролитр мРНК Cas9, 50 нанограмм на микролитр sgРНК и 100 нанограмм на микролитр донорского вектора HMEJ и добавьте воды, чтобы довести окончательный объем до 10 микролитров. Измельчите смесь пипеткой вверх и вниз и положите ее на лед. Далее вытяните капиллярные иглы с помощью съемника микропипетки.
Ввести вероятный объем смеси в цитоплазму зигот с хорошо выраженными пронуклеумами в каплю среды HEPES-CZB, содержащей 5 мкг цитохалазина В на миллилитр, с помощью микроинъектора с постоянными настройками потока. Наконец, культивируют введенные зиготы в среде КСОМ при температуре 37 градусов Цельсия при 5% углекислом газе до стадии бластоцисты через 3 1/2 дня для наблюдения за флуоресценцией. Через 3 дня инъекций 12,9% бластоцист, получавших доноров HMEJ, были положительными на mCherry, который строго экспрессировался в трофэктодерме.
При секвенировании ПЦР-положительных мышей все исследованные события интеграции представляли собой точные внутрикадровые интеграции как на 5 простых, так и на 3 простых соединениях. После 7 дней инъекций иммунофлуоресцентные изображения показали, что почти половина трансфицированных гепатоцитов экспрессировала mCherry в виде окрашенных на срезах печени. После отмены NTBC иммуногистохимическое окрашивание печени скорректированными по Fah гепатоцитами Fah отрицательных мышей, получавших конструкции Fah HMEJ и Cas9, показало более эффективную пролиферацию, чем метод, основанный на MMEJ.
Стратегия, основанная на HMEJ, может быть идеальной платформой для замены мутировавшей последовательности, такой как часть мутации, на правильную. Что неприменимо для метода, основанного на HHEJ. После этого эксперимента эта терапия открывает исследователям путь в область точной интеграции мишеней для изучения широкого применения терапии.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
Стратегия HMEJ представляет собой перспективный генетический инструмент для создания генетически модифицированных животных-моделей и целенаправленных генотерапий. Ее целью является повышение эффективности точной целевой интеграции трансгенов in vivo, обеспечивая терапевтический потенциал для корректировки генных мутаций.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Генетическая инженерия
- Генотерапия
- Применения в нейронауках
Предпосылки
- Система CRISPR/Cas9 является мощным инструментом для генетических модификаций.
- Обусловленное гомологичной концовой соединение (HMEJ) усиливает целевую интеграцию.
- Повышение эффективности интеграции трансгенов имеет решающее значение для терапевтических применений.
- Потенциал для корректировки генных мутаций in vivo.
Цель исследования
- Разработать эффективную стратегию для целевой интеграции ДНК.
- Исследовать применения в создании генетически модифицированных моделей.
- Оценить терапевтический потенциал корректировки генетических мутаций.
Использованные методы
- Использование системы CRISPR/Cas9.
- Реализация техник обусловленного гомологичной концовой соединение.
- In vivo тестирование для оценки эффективности целевой интеграции.
- Оценка применений генотерапии.
Основные результаты
- Продемонстрирована высокая эффективность целевой интеграции трансгенов.
- Показан потенциал для корректировки генных мутаций in vivo.
- Подтверждена эффективность стратегии HMEJ.
- Подчеркнуты возможности для генотерапии в нейронауках.
Выводы
- Стратегия HMEJ является перспективным инструментом для генетической инженерии.
- Она предоставляет жизнеспособный подход для целенаправленных генотерапий.
- Необходимы дальнейшие исследования для оптимизации эффективности интеграции.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
Efficient in vivo targeted integration remains a critical bottleneck for translational gene editing and the generation of disease-relevant animal models. The HMEJ-based CRISPR/Cas9 strategy directly addresses the challenge of precise transgene insertion in non-dividing cells, enabling higher predictive confidence for functional genomics and therapeutic hypothesis testing. This approach supports risk-adjusted portfolio advancement by improving the reliability of genetic model creation and mutation correction workflows.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables precise interrogation of gene function through targeted integration in animal models.
- Supports functional target validation by facilitating correction of disease-causing mutations in vivo.
- Improves predictive confidence for downstream therapeutic hypothesis testing.
Screening & Assay Development
- Provides validated genetic systems for robust assay development and compound screening.
- Enhances reproducibility and standardization by enabling precise genomic modifications.
- Facilitates scalable generation of models for high-throughput screening platforms.
Translational & Preclinical Research
- Aligns with disease-relevant systems by enabling correction of clinically relevant mutations in animal models.
- Supports translational biomarker development through precise genetic manipulation.
- Improves continuity from discovery to preclinical validation by reducing mechanistic ambiguity.
Pipeline & Workflow Integration
This HMEJ-based integration method fits at the interface of early discovery and preclinical model generation, bridging functional genomics with translational research.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification via precise gene editing in vivo.
- Screening: Delivers reproducible, genetically defined models for assay readiness and compound evaluation.
- Analytics: Provides quantitative readouts such as indel frequency and integration efficiency for robust comparison of editing outcomes.
- Translational Research: Enables correction of disease mutations, supporting biomarker alignment and preclinical continuity.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable platform for generating diverse genetically modified models across therapeutic areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in genetic model development.
- Operational Value: Standardizes genome editing workflows for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by enabling reliable model generation.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of gene editing programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9 design, mRNA/sgRNA preparation, and microinjection techniques.
- Demands access to cell sorting, PCR, and sequencing infrastructure for validation.
- Necessitates cross-team standardization of donor vector design and quality control.
- Adaptation across species or cell types may require optimization of homology arm length and delivery conditions.
- Efficiency and precision are dependent on high-quality reagents and careful protocol execution.
