Руководствуясь протокол для фекальных микробиологических характеристик путем Sequencing 16S рРНК ампликонами

Общая цель этого высокопроизводительного секвенирования 16S рРНК-ампликонов состоит в том, чтобы охарактеризовать глобальный состав микробиома, начиная с образцов фекалий. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы о глобальном микробном составе, связанные со многими областями интересов, такими как метаболизм, пищеварение, кишечное и системное воспаление. Основное преимущество данной методики заключается в том, что она обеспечивает учет аэробных и анаэробных микробных сообществ, присутствующих в образце кала, в том числе тех бактерий, которые трудно поддаются культивированию.

Этот метод позволяет одновременно обрабатывать большое количество образцов кала благодаря быстрой линии насоса для обработки без толстой кишки, что привело к надежному и воспроизводимому секвенированию 16S рРНК-ампликонов. Для этого протокола должны быть заморожены образцы кала, которые размером примерно с ластик карандаша. Образцы следует хранить в двух миллилитровых пробирках с обрезанным кончиком тампона для сбора.

Включите отрицательный контроль, состоящий из тампонов без кала и внутренних дубликатов контроля, а также используйте дубликаты образца исходного кала в качестве внутреннего контроля. Начните с размораживания экстракционных и разбавляющих растворов при комнатной температуре вместе с образцами кала и контрольными образцами. После размораживания добавьте 250 микролитров экстракционного раствора в каждую пробирку с образцом и перемешайте кал в раствор с помощью вортекса.

На этом этапе перейдем к негативному контролю, работающему только с буфером. Далее нагрейте образцы в течение 10 минут на кипящей водяной бане. После инкубации в кипящей воде добавьте 250 микролитров раствора разведения в каждый образец и перемешайте образцы вихрем.

Затем храните пробирки с образцами при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока не будет выполнена ПЦР. Настройте ПЦР на рабочей станции перед ПЦР, которая была очищена от потенциальных загрязнителей ДНК, таких как шаблоны и ампликоны. Пометьте грунтовки в соответствии со штрих-кодом и разведите их в воде двойной дистилляции до концентрации 50 микромоляров.

Храните запасы разведенного грунтовки при температуре минус 20 градусов Цельсия и полностью разморозьте их перед использованием. Для каждого образца приготовьте 96-луночный планшет для 32 реакций в трех экземплярах. После нагревания до комнатной температуры разбавьте аликвоты прямого праймера и 32 обратных праймера до пяти микромоляров для ПЦР.

Затем приготовьте достаточное количество оснований для ПЦР смеси на 100 реакций. Соедините 100 микролитров пятимолярного прямого праймера с одним миллилитром мастер-смеси 2X PCR и 400 микролитрами двойной дистиллированной воды. Сделайте эту смесь вихревой, а затем загрузите по 15 микролитров этой смеси в каждую из 96 лунок.

Затем загрузите наборы из трех лунок в каждую с одним микролитром пяти микромоляров обратной грунтовкой. Таким образом, загрузите в пластину все 32 различных индекса реверса. Затем в каждую лунку пластины добавьте четыре микролитра извлеченного образца ДНК.

Делается это на чистом скамейке. Теперь проведите ПЦР с трехминутной начальной денатурацией, за которой последовали 35 циклов с одной минутой денатурации и стоянием на коленях при 55 градусах Цельсия и одной минутой удлинения. Завершите заключительным продлением на 10 минут.

После завершения реакции приступайте к работе на специализированном рабочем столе после ПЦР. Там соедините каждый набор тройных продуктов ПЦР в одну пробирку по 60 микролитров на образец. Затем нанесите четыре микролитра каждого образца на бромид этидия, окрашенный 1% агарозным гелем.

Положительные ампликоны появятся между 375 и 425 парами оснований. Отрицательный контроль показан и обработан вместе с исследуемым положительным Ампликоном. Количественно определите концентрации ДНК продуктов положительной реакции в соответствии с инструкциями производителя.

Затем соедините 500 нанограммов ДНК из каждого из продуктов в одну пробирку. Перемешайте эту смесь и затем выведите 200 микролитров на 1%-ный гель, как и раньше. Теперь извлеките полосы из геля между 375 и 425 парами оснований.

Далее подготовьте библиотеку к секвенированию. Измерьте концентрацию с помощью высокочувствительного двухцепочечного набора для детектирования ДНК в соответствии с инструкциями производителя с последующим использованием высокочувствительного набора для разделения и анализа. Затем разбавьте библиотеку до семи пикомоль и объедините ее четыре к одному с контрольной библиотекой.

Теперь, когда образец готов к секвенированию, перенесите его в машину для секвенирования. Описанный метод библиотечного препарата из образцов кала был использован для анализа микробиома госпитализированных пациентов с подозрением на инфекционную диарею. Параллельно образцы кала также подвергались традиционному культивированию в микробиологической лаборатории.

Образцы стула здоровых взрослых людей были секвенированы для сравнения. Было включено несколько отрицательных контрольных образцов: ПЦР без матрицы, ПЦР на чистых и стерильных тампонах в растворе для экстракции и разведения и ПЦР на смешанных растворах для экстракции и разведения. Каждый из них имел менее 118 прочтений, которые в основном были таксонами микоплазмы.

Стандартные образцы в среднем содержали более 10 000 прочтений без идентификации микоплазмы после контроля качества. Консистенцию и вариабельность образцов измеряли с использованием 16 образцов кала, приготовленных с двумя разными праймерами со штрих-кодом, чтобы создать две разные библиотеки из каждого образца. Половина образцов была положительной на Campylobacter salmonella или Shigella при традиционной технике культивирования.

Используя результаты секвенирования 16S, площадной график на уровне фило показывает согласованность между библиотеками, созданными из одних и тех же образцов, независимо от традиционных результатов культивирования. Из этого пула из 16 парных образцов анализ главных координат показал, что пары образцов тесно выровнены и что положительные образцы культуры имели значительно отличающееся значение PC1 от отрицательных образцов культуры. Дальнейший анализ образцов показал, что высокий уровень протеобактерий был обнаружен только у госпитализированных пациентов.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как одновременно обрабатывать большое количество образцов кала с помощью экстракции ДНК без толстой кишки и ПЦР для генерации библиотек секвенирования со штрих-кодом микробной вариативной области V4. Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости работать в организованной и чистой среде, особенно при подготовке библиотек. Не забывайте, что работа с образцами стула человека опасна, и во время выполнения этой процедуры необходимо всегда надевать средства индивидуальной защиты.