Абсолютная количественная оценка уровня микроРНК в плазме у обезьян Cynomolgus, используя количественные реального времени обратной транскрипции PCR

Общая цель этой процедуры заключается в измерении абсолютных уровней микроРНК плазмы с помощью количественной ПЦР с обратной транскрипцией в реальном времени. Этот метод может помочь оценить количество микроРНК плазмы, даже если уровень их экспрессии низок. Основное преимущество этой методики заключается в том, что измеренные данные можно сравнивать с другими данными из разных исследований или лабораторий.

Последствия этого метода распространяются на образцы других видов, поскольку стандартная кривая может быть сгенерирована с использованием синтетической РНК или нуклеотида. Этот метод может дать представление о трансляционных исследованиях для изучения перспективных биомаркеров безопасности. Сначала разморозьте замороженные образцы плазмы, полученные из бедренной вены обезьян Cynomolgus на льду.

Перенесите реагент Lysis в хлороформ на лед для охлаждения перед экстракцией РНК. Далее добавьте 1 000 микролитров реагента «Лизис» на 200 микролитров образца. И похлопайте в течение одной минуты, чтобы обеспечить правильное перемешивание.

Затем добавьте в образец пять микролитров пяти наномолярных синтетических микроРНК Caenorhabditis elegans и 200 микролитров хлороформа. Перемешайте образец в течение одной минуты, чтобы как следует перемешать. Затем поместите образец на лед на две-три минуты.

Затем центрифугируйте образец при 12 000 G, в течение 15 минут при четырех градусах Цельсия. Далее аккуратно переложите 650 микролитров водной фазы в новую микротрубку. Затем добавьте 975 микролитров этанола в водную фазу и несколько раз пипеткой, чтобы обеспечить полное перемешивание.

Перенесите образец в соответствующую колонку и адаптер, а затем высушите в вакууме в течение трех минут с помощью вакуумных коллекторов. Затем добавьте в колонку 200 микролитров этанола и просушите пылесосом в течение одной минуты. После вакуумной сушки добавьте в колонку 800 микролитров буфера RWT и, опять же, просушите в вакууме в течение двух минут.

Затем добавьте в колонку 800 микролитров буфера RPE и высушите пылесосом в течение двух минут. Добавьте буфер RPE дважды, после чего просушите в вакууме. Далее добавьте в колонку 300 микролитров этанола.

После добавления этанола высушите в вакууме в течение одной минуты. Затем перенесите колонку в новую микропробирку и центрифугируйте ее при 12 000 G при комнатной температуре в течение одной минуты. После центрифугирования перенесите колонку в новую микропробирку и добавьте в нее 50 микролитров воды, не содержащей нуклеазы.

Дайте колонне постоять при комнатной температуре в течение трех минут, а затем центрифугируйте при 8 000 G при комнатной температуре в течение одной минуты. Наконец, храните элюат при температуре минус 80 градусов Цельсия до использования. Чтобы получить концентрацию олигонуклеотидов синтетической РНК, соответствующую целевой микроРНК, разбавьте исходный раствор в 10 раз, чтобы получить рабочий раствор с максимальной концентрацией для построения стандартных кривых.

Затем, чтобы составить мультиплексный пул праймеров обратной транскрипции, смешайте равные объемы праймеров 20-сильной силы для микроРНК-мишеней. Затем приготовьте смесь для реакции обратной транскрипции. Затем добавьте 10 микролитров реакционной смеси обратной транскрипции к пяти микролитрам образца РНК.

Смешайте их с помощью пипетки несколько раз. Затем выдержите смесь на льду в течение пяти минут. Поместив образец в Термоамплификатор, запустите цикл.

После завершения программы храните обратный транскрибированный образец при температуре минус 80 градусов Цельсия. Чтобы составить пул праймеров мультиплексного анализа, добавьте равные объемы по пять микролитров праймеров анализа, соответствующих микроРНК-мишеням, в пробирку, содержащую буфер Tris-EDTA, в конечном объеме 1000 микролитров. Далее составляем предварительную амплификацию реакционной смеси.

После того, как реакционная смесь будет готова, переведите 22,5 микролитра реакционной смеси предварительной амплификации в две целых пять десятых микролитров образца с обратной транскрибацией. Затем с помощью пипетки тщательно перемешайте образец и предварительную амплификацию мастер-смеси и инкубируйте на льду в течение пяти минут, а затем оставьте пробирки ПЦР в термоамплификаторе и начните запуск. Как только программа будет завершена, перенесите все образцы при температуре минус 80 градусов по Цельсию.

После размораживания предварительно амплифицированных или неамплифицированных образцов разбавьте их в пять раз стерильной водой. Чтобы получить стандартную кривую, проведите 10-кратное серийное разведение образцов, полученных из синтетических РНК-олигонуклеотидов. Затем составьте количественную реакционную смесь ПЦР в пробирке, которую держат на льду.

Затем добавьте 18 микролитров из количественной реакционной смеси ПЦР в 96-луночные реакционные планшеты Fast Optical. Затем добавьте в лунки два микролитра разведенных образцов. После запечатывания пластины клейкой пленкой кратковременно центрифугируйте образец при 500 G в течение 15 секунд.

Затем запустите программу Thermocycler в режиме реального времени. Используйте программное обеспечение SDS версии 2.4, которое работает с соответствующим термоциклером в реальном времени для вычисления числа необработанных копий каждого образца. Затем рассчитайте абсолютное число копии из числа необработанной копии с помощью программного обеспечения Excel.

Эффективность амплификации miR-122, miR-192 и miR-133a была проанализирована путем построения стандартных кривых, что объясняет связь между логарифмической концентрацией и циклом количественного определения для образцов без предварительной амплификации. Стандартные кривые для miR-122, miR-192 и miR-133a показывают линейную зависимость между циклами количественного определения и логарифмической концентрацией образцов. Затем была проанализирована эффективность амплификации miR-1, miR-499a и miR-206 путем построения стандартных кривых для предварительно амплифицированных образцов.

Для анализа эффективности усиления наклон был рассчитан с помощью линейной регрессии. Наклон на стандартной кривой А показывает отсутствие специфических ампликонов при концентрации 1000 копий на микролитр для miR-499a и miR-206. Тем не менее, неспецифические ампликоны были получены в концентрации 1000 копий на микролитр для miR-1.

Здесь образцы miR-206 без предварительного и предварительного амплификатора были использованы в дубликатах для получения графиков амплификации. Значения цикла количественной оценки для miR-206 без предварительного и предварительного амплификатора были оценены в 39,9, плюс-минус одна целых девять десятых и 27,0, плюс-минус две целые две целых соответственно, представляя собой почти аналогичные значения между дубликатами, как показано на графиках. Затем микроРНК плазмы, полученные от обезьян Cynomolgus, были подвергнуты профилированию для вычисления их абсолютных значений.

Точечные диаграммы, полученные в результате профилирования микроРНК, представляющие уровни их экспрессии, показывают, что miR-122, miR-133a и miR-192 обнаруживаются без предварительной амплификации. Принимая во внимание, что miR-1, miR-206 и miR-499a потребуют предварительной амплификации из-за низкого уровня экспрессии. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как измерить абсолютные уровни микроРНК плазмы с помощью ОТ-кПЦР.

И предварительное усиление; Это полезно для улучшения обнаружения с небольшими количествами микроРНК.