Западных Blotting протокол для небольшого числа гемопоэтических стволовых клеток

Конечной целью этого протокола вестерн-блоттинга является проведение вестерн-блоттинга на небольшом количестве клеток. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области гемопоэтических стволовых клеток, такие как наличие или обилие специфических белков или активация сигнальных путей. Основное преимущество этого метода заключается в том, что для него требуется менее 20 000 клеток, поэтому для анализа редких популяций первичных клеток требуется меньше животных.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы пытались найти способы уменьшить количество мышей, которых мы должны были использовать для анализа гемопоэтических стволовых клеток. Демонстрировать процедуру будет Сюнвэй Цай, постдок из моей лаборатории. Используйте качающийся ротор ведра для центрифугирования 1,5-миллилитровых пробирок, содержащих отсортированные гемопоэтические стволовые клетки и клетки-предшественники, при гравитации, в 500 раз превышающей силу тяжести, в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

После окончания центрифугирования выбросьте все надсадочную жидкость, кроме 100 микролитров, не повреждая клеточную гранулу. Если клеток менее 5 000, а объем отсортированного образца меньше 0,2 миллилитров, перед центрифугированием сначала переведите клетки в ПЦР-пробирки с низкой связываемостью 0,2 миллилитров. Однако, если клеток меньше 5 000, но объем отсортированного образца составляет более 0,2 миллилитра, то центрифугируйте ячейки при 500-кратной гравитации в течение пяти минут при четырех градусах Цельсия.

После центрифугирования выбросьте все, кроме 200 микролитров надосадочной жидкости. Затем повторно суспендируйте гранулу и оставшиеся 200 микролитров надосадочной жидкости. Далее переложите клеточную суспензию в 0,2 миллилитровые ПЦР-пробирки и снова центрифугируйте.

Затем повторно суспендируйте гранулу в 20-30 микролитрах надосадочной жидкости и выбросьте оставшееся. При необходимости добавьте фосфатно-солевой буфер в 2% фетальную бычью сыворотку или 2% бычий сывороточный альбумин в ресуспензированные клетки. Затем используйте автоматический счетчик клеток для определения концентрации клеток с использованием от двух до пяти микролитров ресуспендированных клеток.

Затем с помощью наконечника для пипетки объемом 20 или 100 микролитров перенесите объем 500, 1000 и 2000 гемопоэтических стволовых и прогениторных клеток в новые 1,5-миллилитровые пробирки. Используйте качающийся ротор ковша для центрифугирования элементов при температуре четыре градуса Цельсия при 500-кратной гравитации в течение пяти минут. Затем следуйте инструкциям производителя по растворению фосфатазы и ингибитора протеасом и ДМСО для приготовления 100-кратного исходного раствора.

Затем разбавьте четырехкратный буфер для образцов Леммли эквивалентными объемами дистиллированной воды, чтобы получить двукратный буфер для образцов Леммли. Затем добавьте соответствующие количества 100-кратного стокового раствора фосфатазы и ингибитора протеасом, чтобы довести конечную концентрацию до двухкратных ингибиторов и двукратного буфера для проб Леммли. Отрегулируйте объем остаточной надосадочной жидкости в пробирке таким образом, чтобы добавление равных объемов двукратного буфера Laemmli вместе с фосфатазой и ингибитором протеасом привело к получению конечной концентрации 500 клеток на микролитр и одного кратного буфера Laemmli.

А затем снова суспензировать, чтобы образовался лизат. Перед загрузкой геля нагрейте лизаты образца при температуре 95 градусов Цельсия в термоблоке в течение пяти минут. Используя стандартные протоколы, электрофорез от одного до 40 микролитров лизата, эквивалентный 500-20 000 клеток, через SDS page при напряжении 100 вольт.

После обработки поливинилиденовой мембраны метанолом в течение нескольких секунд коротко промойте мембрану дистиллированной водой. Затем перенесите белок из геля на мембрану в соответствии с инструкцией, предоставленной производителем передаточного аппарата. После переноса заблокируйте мембрану двумя миллилитрами 2%-ного бычьего сывороточного альбумина и фосфатно-солевого буфера 0,1%-ным твином на ночь при четырех градусах Цельсия в соответствии со стандартными протокалами.

После блокировки мембраны инкубируйте ее с разведенными антителами в течение ночи при четырех градусах Цельсия. Затем трижды промойте мембрану фосфатным буферным физиологическим раствором с 0,1% в течение пяти минут при комнатной температуре. Далее инкубируйте мембрану с двумя миллилитрами усиленного хемилюминесцентного буфера в течение одной минуты при комнатной температуре.

Обнаруживайте сигналы с помощью системы формирования изображений. Для сравнения бета-актиновых сигналов из клеток гемопоэтического ствола и клеток-предшественников мочи получали лизаты и подвергали их анализу по вестерн-графику. Из аминоблоттинга видно, что происходит снижение сигнала бета-актина от лизатов, приготовленных от 2000 до 500 гемопоэтических предшественников и стволовых клеток, загруженных в 1,5-миллиметровые лунки на 12%-ную страницу SDS-геля.

Далее для сравнения сигналы бета-актина, полученные от лунок разных размеров, отлитых на гель. Лизаты загружали в 1,5 и 3 миллиметровые лунки на гель, а затем подвергали вестерн-блоттингу. Блоттинг показывает, что сигнал бета-актина, полученный из лизата, приготовленного из 500 гемопоэтических предшественников, загруженных в 1,5-миллиметровую лунку, значительно сильнее, чем при нагруженном в трехмиллиметровую лунку.

Далее для сравнения сигналов на эукариотический фактор инициации 4G, актин и фосфорилирование рибосомального белка S6 в ответ на стимуляцию цитокиновым фактором стволовых клеток полученные лизаты были проанализированы с помощью аминоблоттинга. Блоттинг показывает наличие более сильных интенсивностей сигнала для всех трех белков в гемопоэтических регенитах при стимуляции фактора цитокиновых стволовых клеток. По сравнению с контролем in vitro также очевидно, что наблюдается и увеличивается интенсивность сигнала для всех трех белков из разных объемов гемопоэтических стволовых клеток.

Как только вы освоите это, технически это можно сделать за 48 часов. Если к нему правильно подойти. При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о точном подсчете клеток и направлении клеток лизата с помощью буфера загрузки.

После этой разработки он технически удаляется для исследователей в области исследований стволовых клеток для изучения сигнальных путей в небольшом количестве клеток. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить западную графику с небольшим количеством адресных элементов. Будьте осторожны с регионами, которые вы используете для страницы SDS.

Спасибо за просмотр. Удачи в ваших экспериментах.