Фермент инженерии Сплит TET2 для химико индуцибельной ДНК Hydroxymethylation и эпигеномные Ремоделирование

Представлены подробные протоколы для внедрения инженерных Сплит TET2 фермента (сидр) в клетки млекопитающих для химических hydroxymethylation индуцибильный ДНК и эпигеномные ремоделирования.

Общая цель этой серии экспериментов заключается во введении сконструированного фермента расщепленного TET2 под названием CiDER в клетки млекопитающих для индуцируемой модификации ДНК, такой как гидроксиметилирование, а также эпигенетическое ремоделирование. Основное преимущество этого метода заключается в том, что сконструированный фермент расщепленного TET2 позволяет осуществлять временный контроль окисления 5-метилцитозина и последующее ремоделирование эпигенетических состояний в клетках млекопитающих с помощью химических добавок. Чтобы начать эту процедуру, культивируют адгезивную клеточную линию в DMEM, дополненную 10% инактивированным при нагревании FBS, а также 100 единиц на миллилитр пенициллина и стрептомицина.

Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия с 5% CO2. Трансфектируйте клетки плазмидой CiDER, как описано в текстовом протоколе. Затем инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия.

На следующий день замените среду, содержащую реагент для трансфекции, на свежую полную DMEM. Чтобы химически индуцировать клетки, добавьте 20 микролитров разведенного рапамицина к трансфицированным клеткам, содержащимся в двух миллилитрах среды, чтобы достичь конечной концентрации 200 наномоляров. Для выполнения проточной цитометрии необходимо ресуспендировать трансфицированные и индуцированные рапамицином клетки в буфере FACS.

В контрольной группе используют клетки, экспрессирующие CiDER, без лечения рапамицином. Зафиксируйте и проникните клетки, как описано в текстовом протоколе. Затем добавьте две обычные соляные кислоты в клетки, чтобы денатурировать ДНК на 10 минут.

После нейтрализации и блокирования клеток, как описано в текстовом протоколе, добавьте в клетки разведенное антитело против 5hmC. Инкубируйте клетки в течение одного часа при комнатной температуре или в течение ночи при четырех градусах Цельсия. После инкубации трижды промойте клетки буфером FACS.

Тщательно извлеките буфер FACS. Добавьте разведенное конъюгированное флуорофором вторичное антитело для анализа FACS и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. Затем трижды промойте ячейки буфером FACS.

После промывки образцы готовы к анализу FACS. Выделите геномную ДНК из трансфицированных и индуцированных рапамицином клеток с помощью коммерческого набора для экстракции ДНК. В контрольной группе используют трансфицированные клетки CiDER без лечения рапамицином.

Нагрейте вакуумную духовку до 80 градусов Цельсия. Предварительно замочите нитроцеллюлозную мембрану в воде двойной дистилляции, а затем в буфере 6X SSC на 10 минут. Затем загрузите 60 микролитров равного количества ДНК в 96-луночный ПЦР-планшет.

В остальные лунки добавьте 30 микролитров TE буфера. Сделайте двойное последовательное разведение по вертикали на 96-луночном планшете, перенеся 30 микролитров раствора в первом ряду в ту же позицию колонки во втором ряду. Еще раз перемешайте и переложите 30 микролитров раствора в лунки в следующем ряду до достижения границы.

Затем удалите из лунки последние 30 микролитров. Далее в каждую лунку добавьте по 20 микролитров одного моляра гидроксида натрия и 10 миллимоляров ЭДТА. Закройте пластину и нагревайте смесь в течение 10 минут при температуре 95 градусов Цельсия, чтобы полностью денатурировать дуплекс ДНК.

Сразу же охладите образцы на льду. Добавьте в каждую лунку по 50 микролитров ледяного двухмолярного ацетата аммония и выдержите на льду 10 минут. Тем временем соберите аппарат для дот-блоттинга с предварительно замоченной мембраной.

Удалите остаточный буфер с помощью полного вакуума. Промойте мембрану, добавив по 200 микролитров TE-буфера в каждую лунку аппарата дот-блот. Включите пылесос, чтобы удалить TE буфер.

Затем загрузите денатурированную ДНК в каждую лунку аппарата дот-блот. Включите пылесос, чтобы удалить раствор. Промойте мембрану, добавив 200 микролитров 2X SSC, и полностью удалите остатки раствора с помощью пылесоса.

Разберите аппарат дот-блот. Затем выньте мембрану и промойте всю мембрану 20 миллилитрами 2X SSC. Просушите мембрану на воздухе в течение 20 минут.

Чтобы дополнительно высушить мембрану, запекайте ее при температуре 80 градусов под вакуумом в течение двух часов. Добавьте блокирующий раствор на мембрану и выдерживайте в течение часа при комнатной температуре. Выбросив блокирующий раствор, добавьте разведенные антитела 5-hmC или 5-mC к мембране и инкубируйте в течение ночи при четырех градусах Цельсия.

Промойте мембрану TBST три раза в течение 10 минут, чтобы удалить остатки антител. После тщательного удаления TBST добавьте к мембране конъюгированное HRP вторичное антитело. Инкубируйте мембрану в течение одного часа при комнатной температуре.

Промойте мембрану с TBST три раза в течение 10 минут. Наконец, добавьте к мембране подложку ECL western blotting для визуализации сигналов 5-hmC с помощью хемилюминесцентного детектора. Здесь представлен репрезентативный результат количественной оценки CiDER-опосредованного производства 5-hmC с помощью проточной цитометрии.

Только клетки, экспрессирующие CiDER в условиях, обработанных рапамицином, демонстрируют значительное повышение уровня 5-hmC. Здесь показан репрезентативный результат глобального изменения уровня 5-hmC во всей клеточной популяции с помощью дот-блот-анализа. Контроль загрузки визуализируется путем окрашивания общим количеством входной ДНК этиленовым синим.

Результаты показывают, что лечение рапамицином индуцирует устойчивую продукцию 5-hmC в клетках HEK293T, экспрессирующих CiDER, с незначительной фоновой активностью. После освоения этой техники ее можно сделать за неделю, если ее правильно выполнить. После своего развития этот метод проложил путь исследователям в области эпигенетики к изучению клеточных функций без изменения генетического кода и исследованию эпигенотипических и фенотипических отношений в различных биологических системах.