Высокое разрешение 3D визуализации нейро островной сети человека поджелудочной железы

Общая цель данного протокола состоит в том, чтобы продемонстрировать оптимизированный метод пассивного оптического очищения, который подходит для использования с тканями поджелудочной железы человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области нейробиологии, связанные с диабетом, предоставляя подробную информацию об иннервации островков. Основным преимуществом этого метода является то, что метод очистки обеспечивает прозрачность ткани поджелудочной железы человека для использования в конфокальной визуализации с высоким разрешением.

Для начала зафиксируйте образец поджелудочной железы, поместив его в свежеприготовленный 4% параформальдегид, и инкубируйте образец при температуре четыре градуса Цельсия в течение 48 часов. Далее охладите колбу, поместив ее в ведро со льдом. А затем поставьте ведро на магнитную пластину для перемешивания.

Убедитесь, что колба сидит ровно, и добавьте магнитную мешалку. Налейте в колбу 147,8 миллилитров ледяной дистиллированной, деионизированной воды. Затем добавьте 20 миллилитров 0,1 молярного PBS, 20 миллилитров ледяного 40% раствора акриламида, 12,2 миллилитров 16% раствора параформальдегида и 250 миллиграммов инициатора VA-044.

Перемешайте весь гидрогелевый раствор не менее 10 минут. Затем поместите коническую трубку объемом 15 миллилитров в лед рядом с колбой с раствором гидрогеля. Пипеткой внесите в пробирку 14 миллилитров раствора мономера.

и добавьте по одному кусочку неподвижного и разрезанного образца ткани. Затем закупорьте тюбик. Инкубируйте образец в растворе мономера в течение 3 дней при температуре четыре градуса Цельсия, при этом защищайте от света.

После инкубации поместите образец на лед. Далее подсоедините трубку к азотному баку через запорный кран. Держа образец на льду, осторожно с помощью иглы для подкожных инъекций 18 калибра проткните крышку конической трубки, содержащей образец, с одной стороны.

Вставьте иглу в трубку до тех пор, пока она не окажется под поверхностью жидкого раствора мономера. Затем используйте другую иглу для подкожных инъекций 18 калибра, чтобы проколоть противоположную сторону колпачка, но не позволяйте ему погрузиться в раствор, чтобы он мог действовать как вентиляционное отверстие. Подсоедините трубку от азотного бака к игле для подкожных инъекций, погруженной под гидрогель, и медленно включайте азот, пока он не начнет равномерно пузыриться в жидкости.

После дезоксигенации быстро извлеките обе иглы и накройте колпачок парафиновой пленкой, чтобы предотвратить дальнейший обмен газов между трубкой и окружающей средой. Наконец, поместите образец в инкубатор при температуре 37 градусов Цельсия на три часа, чтобы полимеризовать гидрогель. После полимеризации слейте любой оставшийся гидрогель.

Затем промойте образец в 3-5 обменах 0,01 молярного PBS в течение 15 минут на каждом этапе промывки. После промывки переложите образец в коническую пробирку объемом 50 миллилитров, содержащую 40 миллилитров или буфер для очистки. Инкубируйте образец в буфере для очистки при температуре 37 градусов Цельсия и меняйте образец на свежий буфер для очистки через день.

Чтобы проверить правильность прояснения, поднесите образец к свету и убедитесь, что образец пропускает через себя свет, но сохраняет некоторую коричневую окраску в экзокринных областях. Чрезмерно очищенный образец будет выглядеть потертым по краям, а текстура будет очень мягкой при захвате щипцами. Обычно образец очищается неравномерно.

Замените очищающий буфер на 40 миллилитров 0,01 молярного PBS и поместите образцы на шейкер при 60 оборотах в минуту на один день при комнатной температуре. Выполните четыре-пять замен буфера и дайте окончательной стирке продолжаться в течение ночи. Затем приготовьте окрашивающий буфер PACT в пробирке с плоским дном объемом 2 миллилитра и добавьте 2% обычной сыворотки к 1 миллилитру базового буфера PACT.

Затем добавьте примерно в пять раз больше стандартного количества первичного антитела в буфер для окрашивания. С помощью шпателя извлеките образец из буфера для промывки и промокните излишки буфера на бумажное полотенце. Поместите образец в пробирку с первичным раствором антитела и инкубируйте его в растворе в течение двух-четырех дней при комнатной температуре, на шейкере, при 60 оборотах в минуту.

После инкубации удалите раствор антитела и добавьте 0,01 моляра PBS. Тщательно промойте образцы в шейкере при 60 об/мин, четыре-пять раз меняя на свежий буфер и оставляя окончательную промывку в шейкере на ночь. Затем добавьте вторичное антитело в соотношении от 1 до 200 в окрашивающий буфер PACT с добавлением сыворотки 2%.

С помощью шпателя извлеките образец из буфера для промывки и промокните излишки буфера на бумажное полотенце. Затем поместите образец в пробирку с раствором вторичного антитела. Защищайте образец от света во время инкубации образца при комнатной температуре на шейкере со скоростью 60 об/мин в течение двух дней.

После инкубации удалите раствор антитела и замените его 0,01 молярного PBS. Тщательно промойте образцы на шейкере при 60 об/мин, четыре-пять раз меняя на свежий буфер, и оставьте окончательную промывку в шейкере на ночь. Для начала приготовьте буфер для соответствующего раствора с показателем преломления, сначала взвесив 11 граммов неионогенной градиентной среды плотности и осторожно перенеся ее в коническую пробирку объемом 50 миллилитров.

Затем добавьте 5 миллилитров 0,02 молярного фосфатного буфера с помощью шпателя для выпуска воздуха из порошкообразной неионогенной среды градиента плотности. При необходимости доведите объем до 10 миллилитров, используя больше 0,02 молярного фосфатного буфера, перемешайте его шпателем, а затем соскребите излишки с лопатки в трубку. Инкубируйте буфер при температуре 37 градусов Цельсия до полного растворения, периодически переворачивая и осторожно перемешивая.

Перенесите образцы в буфер для соответствующего раствора с показателем преломления и инкубируйте их на столе, защищенном от света, в течение двух-четырех дней перед визуализацией. Непосредственно перед получением изображения поместите небольшое количество раствора для согласования показателя преломления в предметное стекло нижней камеры с восемью лунками. Затем добавьте образец в лунку и закройте предметное стекло крышкой.

В поджелудочной железе человека островки могут быть очерчены инсулином, глюкагоном и секретируемым Grana Three для бета-клеток, альфа-клеток или всех эндокринных клеток соответственно. Шванновские клетки выглядят белыми, а эндокринные клетки окрашены либо инсулином, либо глюкагоном. Нервы, проходящие рядом с кровеносными сосудами на периферии островков, выделяются белыми линиями и простираются внутрь островков.

Здесь отчетливо виден контакт между шванновскими клетками и эндокринными клетками. В данном случае образец, полученный с использованием методов, показанных в этом видео, был окрашен на вазоактивный кишечный пептид и визуализирован с помощью светового листового микроскопа. Нервные волокна хорошо видны в высоком разрешении и показаны оборачивающими проток на переднем плане и ганглий на заднем плане.

При попытке выполнить эту процедуру важно помнить о необходимости использования ацинарных областей поджелудочной железы, которые не имеют крупных протоков и сосудов.