Применение РНК-интерференции и тепло шок индуцированной выражение фактор транскрипции для перепрограммирования клетки семенозачатка нейронов в C. elegans

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы индуцировать превращение половых клеток в нейроны у C.elegans. Этот метод может помочь в исследовании влияния биологических процессов, таких как сигнальные пути или эпигенетика, на регуляцию перепрограммирования клеточной судьбы. Основное преимущество метода, описанного в этом видео, заключается в том, что у живых животных половые клетки могут подвергаться воздействию сверхэкспрессии транскрипционного фактора, вызывающего судьбу.

Параллельно можно проводить генетический скрининг, такой как скрининг РНК-интерференции, чтобы выявить новые факторы, участвующие в регуляции клеточного перепрограммирования. Применение этой техники распространяется и на регенеративную терапию. Потому что этот метод in vivo может быть использован для изучения клеточного перепрограммирования в различных условиях развития и окружающей среды.

Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так как шаги перепрограммирования сложны для изучения. Потому что фенотип превращения зародышевых клеток в нейроны при истощении lin-53 происходит только в тщательно контролируемых условиях. Для пластин РНК-интерференции загрузите шестисантиметровые пластины NGM агаром, содержащим IPTG и карбенициллин.

Дайте им высохнуть от 24 до 48 часов при комнатной температуре в темноте. Затем перенесите их в четыре градуса Цельсия на срок до 14 дней. Затем селективные планшеты, содержащие карбенициллин и тетрациклин, содержат клоны РНК-интерференцированных бактерий с плазмидой L4440, несущей ген lin-53.

Используйте трехфазный шаблон полос и обязательно нанесите пустой векторный контроль. Затем вырастите пластины в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию. На следующий день выберите не менее трех одиночных колоний и закиньте каждую из них в отдельную культуральную пробирку двумя миллилитрами LB, дополненными карбенициллином, но не тетрациклином.

Планируйте проведение трех здоровых культур для каждого состояния. Затем выращивайте культуры в течение ночи при температуре 37 градусов по Цельсию, пока они не достигнут оптической плотности на уровне 600 нанометров от 0,6 до 0,8. Затем добавьте по 500 микролитров каждой бактериальной культуры в шестисантиметровую пластину NGM агаровой РНК-интерференции.

Инкубируйте пластины в течение ночи при комнатной температуре в темноте. Этот протокол оптимизирован для червей штамма BAT28, содержащихся при температуре 15 градусов Цельсия, при которой трансгены наиболее стабильны. Подробно о генетике штамма читайте в тексте.

Возрастная синхронизация червей имеет решающее значение. Используйте технику отбеливания. Вымойте шестисантиметровые пластины NGM агара, содержащие взрослых особей и яйца, используя 800 микролитров M9. Затем гранулируйте червей центрифугированием, и удалите надосадочную жидкость.

Далее добавьте к червям от 1/2 до одного миллилитра отбеливающего раствора. А наблюдая за червями под стереоскопом, встряхивайте трубку до тех пор, пока взрослые черви не начнут лопаться, а затем собирайте икринки. Теперь отделите отходы от яиц.

Сначала центрифугируйте пробирку, а затем утилизируйте надосадочную жидкость. Затем промойте гранулу салфеток 800 микролитрами М9 три раза. Обязательно используйте центрифугирование, чтобы объединить салфетки между мытьями.

Теперь переложите очищенные яйца в свежие тарелки NGM, засеянные бактериями OP50. Кратко проверьте на успешность выделения эмбрионов и их перенос в планшеты NGM. Выращивайте животных при температуре 15 градусов по Цельсию.

Чтобы достичь конверсии зародышевых клеток в нейроны при истощении lin-53, истощение должно начаться в родительском поколении. Чтобы истощить lin-53, подвергайте животных L4 воздействию РНК-интерференции. Вручную перенесите 50 червей L4 на репликацию на планшет NGM RNAi без бактерий.

Используйте платиновую проволоку. Червей L4 можно узнать по белому пятну примерно на полпути вдоль их брюшных сторон. Теперь инкубируйте червей при температуре 15 градусов Цельсия в темноте в течение примерно семи дней.

IPTG светочувствительна. Когда потомство F1 достигнет стадий L3 и L4, отделите его от более крупных и толстых родительских животных. На этом этапе проведите скрининг F1 на фенотип выступающей вульвы, который указывает на то, что РНК-интерференция против lin-53 была успешной.

Активность РНК-интерференции также может привести к летальности, которая увеличивается выше 15 градусов по Цельсию. Чтобы активировать che-1 и вызвать преобразование зародышевых клеток в нейроны у потомства F1, подвергните червей тепловому шоку в течение 30 минут при температуре 37 градусов Цельсия в темноте. Используйте вентилируемый инкубатор, так как он обеспечивает более эффективный тепловой шок.

После теплового шока инкубируйте тарелки при температуре 25 градусов Цельсия на ночь в темноте. Важно избегать индуцирования сверхэкспрессии che-1 тепловым шоком до того, как животные достигнут средней стадии L3. Это может привести к экспрессии белка che-1 в нецелевых тканях.

На следующий день установите источник флуоресцентного света и фильтр GFP для обследования животных на наличие трансгенной флуоресценции в средней части тела. Чтобы оценить пенетрантность фенотипа, находят соотношение животных, излучающих флуоресцентный сигнал. Как правило, около 30% показывают дискретный сигнал GFP.

Для сравнения, у животных, несущих пустую векторную РНК-интерференцию, даже диффузный сигнал в зародышевой линии не наблюдается более чем у 5% популяции. Животные F1 с выпячивающимся фенотипом вульвы иллюстрируют успешное применение РНК-интерференции lin-53. У этих животных часто происходит превращение зародышевых клеток в нейроноподобные клетки ASE при индукции теплового шока che-1.

При тщательном рассмотрении выявляются нейроноподобные проекции, которые типичны для нейронов из клеток зародышевой линии. Напротив, контрольные элементы с пустыми векторами показали минимальную экспрессию GFP, которая была в лучшем случае диффузной. Половые клетки у этих животных не имели нейроноподобных особенностей.

Когда животные были слишком молоды во время индукции сверхэкспрессии che-1, они часто проявляли экспрессию эктопических трансгенов в других областях тела, таких как развивающаяся вульва. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как тщательно планировать и проводить эксперименты с использованием живых червей для перепрограммирования половых клеток в нейроны. Метод, описанный в этом видео, позволит вам теперь исследовать влияние ряда различных факторов на регуляцию клеточного перепрограммирования.

После освоения этой процедуры ее можно делать уже через 10 дней. При проведении эксперимента важно тщательно распределить животных перед индукцией перепрограммирования и поддерживать температуру штамма BAT28 на уровне 15 градусов. После этой процедуры можно использовать другие методы, такие как двойная РНК-интерференция, чтобы ответить на дополнительные вопросы, такие как: Каковы основные механизмы, которые играют роль во время конверсии судьбы клетки?