На месте молекулярной обнаружение почвообитающих фитопатогенов, используя систему портативный ПЦР в реальном времени
23 февраля 2018 г.
Быстрого и точного обнаружения патогенов растений на местах, особенно почвообитающих патогенных микроорганизмов, имеет решающее значение для предотвращения дальнейшего производства посевным материалом и распространения заболеваний растений в поле. Разработанный метод здесь, с помощью портативной системы обнаружения ПЦР в реальном времени позволяет на месте диагноз в полевых условиях.
Здравствуйте, меня зовут Джозеф ДеШилдс, я работаю на кафедре патологии растений в Университете штата Вашингтон, и сегодня я покажу вам протокол обнаружения почвенных болезней на месте. Диагностика болезней растений в полевых условиях имеет решающее значение для эффективной борьбы с болезнями и в конечном итоге может снизить вторичное распространение патогенов в поле. Патогены, передающиеся через почву, особенно трудно диагностировать из-за большой и сложной почвенной среды, и это может затруднить понимание болезней, передающихся через почву. Полимеразная цепная реакция, также известная как ПЦР, в настоящее время является наиболее широко распространенным чувствительным и точным подходом к обнаружению патогенов растений в полевых условиях. В приведенном ниже протоколе продемонстрирован чувствительный и стационарный метод обнаружения патогенов, передающихся через почву, состоящий из экстракции ДНК на основе магнитных шариков, ПЦР, которая может быть выполнена с помощью портативного прибора для ПЦР, и анализа данных, который может быть выполнен дистанционно с помощью портативного компьютера. Экстракция ДНК на основе магнитных шариков. Набор для экстракции ДНК и РНК был подготовлен и использован в соответствии с инструкциями производителя с небольшими изменениями. Все реагенты хранили при комнатной температуре, а полученную протеиназу К хранили при температуре 20
Обзор
В данной статье представлена портативная система ПЦР-диагностики в реальном времени для экспресс-анализа почвенных патогенов растений на месте их обнаружения. Быстрое выявление патогенов имеет решающее значение для эффективной борьбы с болезнями и предотвращения их распространения.
Основные компоненты исследования
Область науки
- Патология растений
- Микробиология почвы
- Полевая диагностика
Теоретическая основа
- Почвенные патогены трудно диагностировать из-за сложности почвенной среды.
- Диагностика на месте имеет решающее значение для эффективного управления болезнями растений.
- Полимеразная цепная реакция (ПЦР) является широко признанным методом обнаружения патогенов.
- Портативные системы ПЦР позволяют проводить диагностику непосредственно в полевых условиях.
Цель исследования
- Разработать чувствительный и точный метод обнаружения почвенных патогенов.
- Продемонстрировать использование портативной системы ПЦР для диагностики непосредственно на месте.
- Снизить риск вторичного распространения патогенов в сельскохозяйственной среде.
Используемые методы
- Экстракция ДНК с использованием магнитных частиц.
- ПЦР в реальном времени для детекции патогенов.
- Использование портативного ПЦР-амплификатора для полевого анализа.
- Дистанционный анализ данных с помощью ноутбука.
Основные результаты
- Разработанный метод позволяет быстро выявлять почвенные патогены.
- С помощью этой портативной системы можно эффективно контролировать полевые условия.
- Диагностика на месте позволяет предотвратить дальнейшее накопление инокулята.
- Данный протокол применим для различных типов почвенных сред.
Выводы
- Портативная система ПЦР расширяет возможности диагностики почвенных патогенов непосредственно в полевых условиях.
- Быстрое и точное обнаружение имеет решающее значение для эффективного управления заболеваниями.
- Данный метод может внести значительный вклад в сокращение распространения болезней растений.
Часто задаваемые вопросы
Практическая значимость для отрасли
Быстрое обнаружение почвенных патогенов непосредственно на месте позволяет своевременно вмешиваться в технологические процессы сельскохозяйственной биотехнологии, сокращая потери урожая и поддерживая стратегии прогностического управления заболеваниями. Портативная молекулярная диагностика связывает полевой отбор проб с лабораторной валидацией, ускоряя принятие решений на ранних стадиях разработки агрохимикатов и биопестицидов. Такой подход улучшает валидацию мишеней в исследованиях взаимодействия растений и патогенов, обеспечивая количественные и воспроизводимые данные о патогенной нагрузке непосредственно из сложных природных матриц.
Стратегическое применение в биофармацевтических исследованиях и разработках
Первичный поиск и валидация мишени
- Научная ценность: обеспечивает функциональную валидацию факторов вирулентности патогена посредством количественного определения копий ДНК в почве.
- Практическая ценность: способствует проверке гипотез в рабочих процессах валидации мишеней, обеспечивая воспроизводимое количественное определение патогена в образцах, собранных в полевых условиях.
- Прогностическая ценность: позволяет получить данные о зависимости «доза-ответ» для скрининга противомикробных или преодолевающих резистентность соединений в реалистичных условиях окружающей среды.
Скрининг и разработка анализа
- Готовность анализа: экстракция нуклеиновых кислот с использованием магнитных частиц обеспечивает стандартизированную, устойчивую к ингибиторам подготовку образцов для высокопроизводительного обнаружения патогенов.
- Количественный результат: ПЦР в реальном времени с использованием флуорогенных зондов позволяет получать значения Ct, что дает возможность определить предел обнаружения (вплоть до 100 копий) для оптимизации анализа.
- Переносимость платформы: совместимость протокола с портативными приборами поддерживает децентрализованные рабочие процессы скрининга в географически распределенных центрах исследований.
Трансляционные и доклинические исследования
- Система, релевантная заболеванию: использование Spongospora subterranea в почвенных матрицах для моделирования реальных проблем обнаружения патогенов в клубневых культурах.
- Трансляционная преемственность: обеспечивает связь между разработкой лабораторных методов анализа и диагностикой, применимой в полевых условиях, что снижает трансляционный риск в сельскохозяйственной биотехнологии.
- Механистическое снижение рисков: позволяет мониторить динамику патогенной нагрузки для оценки механизма действия биологических препаратов или химических средств защиты, вносимых в почву.
Интеграция в конвейер и рабочий процесс
Данный метод вписывается в континуум от фундаментальных открытий к трансляционным исследованиям, позволяя проводить количественную оценку патогенов на ранних этапах валидации мишеней, поддерживать стандартизацию анализа при скрининге и предоставлять данные для принятия решений о целесообразности дальнейшей разработки средств защиты растений на доклиническом этапе.
- Фундаментальная биология: Облегчает проверку гипотез о взаимодействии патогена и хозяина посредством точного количественного определения целевой ДНК в естественных почвенных средах.
- Скрининг: Обеспечивает стандартизированные количественные результаты детекции патогенов, подходящие для оценки библиотек соединений в форматах почвенных анализов.
- Аналитика: Позволяет получать воспроизводимые значения Ct и кривые амплификации, которые служат основой для статистического сравнения эффектов воздействия в различных экспериментальных условиях.
- Трансляционные исследования: Обеспечивает преемственность от контролируемых лабораторных анализов к исследованиям по полевой валидации за счет сохранения эффективности анализа для различных типов образцов.
- Корпоративное повторное использование: Создает переносимую, воспроизводимую платформу для детекции патогенов, применимую к нескольким системам «культура–патоген» в глобальных научно-исследовательских сетях.
Операционное и корпоративное воздействие
- Научная ценность: Снижает механистическую неопределенность в исследованиях взаимодействия растений и патогенов, обеспечивая точные, подтвержденные полевыми данными измерения патогенной нагрузки.
- Операционная ценность: Повышает воспроизводимость и масштабируемость обнаружения патогенов на различных полевых участках за счет стандартизированных протоколов экстракции и амплификации.
- Стратегическая ценность: Повышает достоверность принятия решений о продолжении или прекращении разработки (go/no-go) на ранних стадиях программ защиты сельскохозяйственных культур за счет снижения частоты ложноотрицательных результатов при обнаружении патогенов.
- Влияние на портфель: Позволяет осуществлять приоритизацию ведущих кандидатов с учетом рисков на основе продемонстрированной эффективности в условиях реалистичного давления патогенов.
Особенности реализации
- Для разработки и интерпретации анализа требуются экспертные знания в области молекулярной диагностики и фитопатологии.
- Метод зависит от наличия портативных приборов для ПЦР в реальном времени и совместимых наборов флуорогенных зондов.
- Для обеспечения сопоставимости данных необходима стандартизация протоколов сбора и обработки образцов на всех полевых участках.
- Необходимо учитывать влияние ингибиторов ПЦР почвенного происхождения путем валидации эффективности экстракции на магнитных частицах в целевых матрицах.
- Метод ограничен детекцией нуклеиновых кислот; без дополнительных анализов он не позволяет оценить жизнеспособность или инфекционность патогена.
