Простой метод для высокой пропускной способности химического скрининга в Caenorhabditis Elegans

Общая цель этого метода состоит в том, чтобы проверить влияние различных соединений на модельные организмы C.elegans в высокопроизводительном анализе. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области химии, биологии и старения, например, продлевают ли определенные химические структуры продолжительность жизни C.elegans? Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет быстро и быстро проводить скрининг многочисленных соединений.

Чтобы подготовить массовую культуральную тарелку для производства большого количества червей, в ламинарном проточном шкафу сначала раздайте 30 миллилитров агара нематоды 60 градусов Цельсия на 10-сантиметровые культуральные пластины для застывания в течение ночи. На следующее утро добавьте два миллилитра концентрированной кишечной палочки на каждую тарелку, наклоняя и вращая пластину, чтобы бактерии полностью распределились по поверхности пластины. Когда тарелки массового культивирования высохнут, храните их при температуре четыре градуса Цельсия до двух недель.

Чтобы подготовить высокопроизводительные планшеты для посевов для пробирного анализа к скринингу, используйте автоматизированный восьмиканальный дозатор для добавления 0,15 мл агара расплавленной нематоды в каждую лунку 96-луночного планшета. Дайте агару застыть в течение ночи. Затем храните высокопроизводительные пробирные пластины при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух недель.

Чтобы установить культуры C.elegans, используйте червячную кирку и препарирующий микроскоп, чтобы перенести 20 яиц на каждую массовую культуральную пластину и инкубировать пластины при температуре 20 градусов Цельсия в течение шести дней. На седьмой день используйте препарирующий микроскоп, чтобы визуально подтвердить наличие яйцеклеток в матке. Чтобы собрать вес взрослых особей, с помощью стеклянной пипетки добавьте два-три миллилитра S-базального раствора на тарелку и перемешайте растворы вокруг каждой пластины вручную.

С помощью стеклянной пипетки переложите червей в 15-миллилитровую пробирку и измельчите червей методом центрифугирования. Повторно суспендируйте червей в 10 миллилитрах раствора гипохлорита и быстро встряхивайте трубки вверх и вниз в течение пяти секунд. Затем высиживайте червей в течение пяти минут при комнатной температуре с встряхиванием каждые 2,5 минуты.

По окончании инкубации снова центрифугируйте червей. Гранулы должны быть желтовато-коричневого цвета. Замените надосадочную жидкость на 10 миллилитров свежего раствора гипохлорита и снова энергично встряхните трубку.

Инкубируйте червей еще одну-три минуты, время от времени встряхивая. Когда останутся только яйцеклетки, центрифугируйте пробирки и отсасывайте надосадочную жидкость. Гранулы должны быть белыми без коричневой окраски.

Используя стерильную методику, откройте пробирки в стерильном ламинарном шкафу и добавьте 14 миллилитров S базального раствора в каждую гранулу. Промойте гранулу три раза с 14 миллилитрами S Basal. После трех промываний центрифугированием повторно суспендируйте яйца в двух-трех миллилитрах свежего S-базального раствора.

Чтобы приготовить личинок стадии L1 C.elegans, перенесите надосадочную жидкость в одну стерильную стеклянную чашку Петри на каждую пробирку и используйте два-три миллилитра S-базального раствора для промывания оставшихся яиц из пробирок в каждую чашку. Добавьте пять миллилитров базального раствора S в каждую посуду, чтобы облегчить скопление людей, и поставьте тарелку на орбитальный шейкер при температуре 20 градусов Цельсия и 20 оборотах в минуту на 16-24 часа, чтобы стимулировать вылупление. Все вылупившиеся птенцы останавливаются на первой личиночной стадии из-за нехватки пищи.

С помощью серологической пипетки перенесите личинки L1 в 15-миллилитровую пробирку для их центрифугирования. После того как все вылупившиеся L1 были затвердевают путем повторного центрифугирования и аспирации, повторно суспендируйте гранулу личинки 10 миллилитрами стерильного S базального раствора. Затем переложите 10 микролитров в незасеянную тарелку и посчитайте количество личинок, которые присутствуют на пластине.

Повторите это 10 раз, чтобы получить среднюю плотность L1s в вашем решении. С помощью стерильной серологической пипетки определите общий объем раствора, содержащего L1s. Затем используйте объем раствора L1 и плотность L1 в растворе, чтобы вычислить общее количество L1, присутствующих в растворе.

Чтобы поместить червей в 96-луночный высокопроизводительный испытательный планшет, разбавьте суспензию L1 до одной личинки L1 на микролитр в стерильной круглой бутылке для фильтрующего материала, снабженной умеренно медленно вращающейся мешалкой, и дайте пробирным пластинам нагреться до комнатной температуры. Затем в ламинарный шкаф добавьте пять микролитров концентрированной кишечной палочки в каждую лунку, а затем 10 микролитров суспензии L1 в лунку, чтобы получить в среднем 10 червей на лунку. Когда все черви будут покрыты, накройте пластины и инкубируйте червей в течение двух дней при температуре 25 градусов Цельсия, чтобы позволить личинкам развиться во взрослых особей.

По окончании инкубации доведите пластины химической библиотеки до комнатной температуры от замерзания. Осторожно встряхните размороженные пластины со скоростью 60 об/мин на вибростенде для микропланшетов в течение одной минуты непосредственно перед использованием. С помощью автоматизированного манипулятора для обработки жидкостей на 96 лунок перенесите 0,75 микролитра соединения из библиотечной пластины в пробирную пластину.

Когда все лунки будут обработаны, высушите соединение на воздухе с поверхности пластин в ламинарном шкафу в течение четырех-восьми часов, удаляя отдельные пластины, как только они высохнут. Заклейте высушенные пластины прозрачной пленкой и накройте их крышками. Затем вращайте пластины в течение 45 секунд при температуре 1000 G и храните их в перевернутом положении при температуре 25 градусов Цельсия.

Чтобы проверить реакцию C.elegans на интересующие соединения, можно использовать отрицательную контрольную пластину для оценки общей выживаемости до тех пор, пока 95% контрольных животных не умрут, после чего могут быть оценены все тестовые пластины. Например, в этом исследовании было обнаружено 57 попаданий из библиотеки повторных тестов из 179 соединений, что свидетельствует о том, что в общей сложности 32% химических веществ повторного тестирования дали положительный результат. Группирование усредненных процентных живых баллов для отрицательных контрольных и испытательных скважин показало, что тестовые скважины превзошли контрольные скважины.

Также могут быть проведены маломасштабные скрининги, как показано в этом репрезентативном тестовом анализе, в котором использовались 50 микромолярных и 100 микромолярных концентраций исследуемого соединения. Повторная оценка этих тестовых планшетов с малым экраном, когда более 99% животных, обработанных отрицательным контролем, были мертвы, показала, что положительные контрольные лунки намного превосходили отрицательные контрольные и тестовые лунки в том смысле, что тестовые лунки показали несколько лучшие результаты, чем отрицательные контрольные. В данном эксперименте последний результат был искажен указанием на то, что многие из испытательных лунок проявляли токсичность по сравнению с контрольной обработкой, тем самым искажая эту простую интерпретацию.

После освоения эта техника может быть завершена за две-четыре недели при правильном выполнении. При выполнении этой процедуры важно сохранить целостность пластин для анализа, убедившись, что они безупречны перед использованием. Следуя этой методике, можно получить ответы на дополнительные вопросы, например, какое из этих соединений вызывает миофагию?

Для анализа митофагии будет использоваться репортерная цепь миофагии. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как провести высокопроизводительный химический скрининг с использованием C.elegans в качестве модельного организма.