Метаболические маркировки и профилирование передачи РНК с помощью Macroarrays

Общая цель этой процедуры заключается в одновременном измерении клеточных уровней всех транспортных РНК в биологических образцах путем сочетания метаболического мечения in vivo с макроматричным анализом. Транспортные РНК долгое время рассматривались как молекулы-хозяева, которым не хватало регуляторных функций. Тем не менее, растущее количество доказательств указывает на то, что уровни клеточной тРНК колеблются в ответ на различные условия, такие как тип клеток, окружающая среда и стресс.

Колебания экспрессии тРНК напрямую влияют на трансляцию генов, способствуя или подавляя экспрессию определенных белков. Для понимания динамики синтеза белка требуются методы, способные получить высококачественные профили тРНК. Мы представляем здесь надежную и простую методику, которая позволяет быстро и точно количественно определять уровни транспортной РНК в организмах, выращенных в лаборатории.

Для начала с помощью иглы 18-го калибра поместите одно отверстие в центр колпачка стерильной микроцентрифуги объемом 1,5 миллилитра, чтобы обеспечить надлежащую аэрацию. Затем пятью микролитрами Mycobacterium smegmatis из ночной закваски инокулируйте 500 микролитров стерильного бульона 7H9. Следуя стандартным методам радиозащиты, добавьте в питательную среду 20 микрокюри на миллилитр ортофосфата, меченного фосфором-32.

Выращивайте бактерии при температуре 37 градусов Цельсия и 1 200 оборотах в минуту в шейкере-инкубаторе, расположенном за акриловым экраном толщиной девять миллиметров. В середине логарифмической фазы переложите всю культуру в двухмиллилитровую пробирку с завинчивающейся крышкой и измельчите радиоактивные бактерии при комнатной температуре, центрифугируя при 10 000-кратном течении силы тяжести в течение двух минут. Соберите надосадочную жидкость, содержащую неинкорпорированный радиоактивный ортофосфат, в соответствующий контейнер для отходов.

Чтобы приготовить общую РНК, добавьте в гранулу один миллилитр коммерческого реагента для экстракции РНК и примерно 200 микролитров стеклянных шариков. Надежно закройте пробирку крышкой и разбейте бактерии в гомогенизаторе при максимальном перемешивании в течение двух минут. Центрифугируйте образец при давлении в 12 000 раз и четырех градусах Цельсия в течение 10 минут.

Затем переложите надосадочную жидкость в новую двухмиллилитровую трубку и соответствующим образом выбросьте шарики. Добавьте 0,2 миллилитра хлороформа, и энергично встряхивайте тюбик рукой в течение 15 секунд. Затем центрифугируйте образец при давлении в 12 000 раз сильнее и четырех градусах Цельсия в течение 15 минут.

Соберите водную фазу образца в новую пробирку, наклонив трубку под углом 45 градусов. Избегайте рисования межфазного или органического слоя. Добавьте два микролитра цветного осадителя и 0,5 миллилитра 100% изопропанола в водную фазу.

Энергично встряхните пробирку рукой в течение пяти секунд и снова центрифугируйте. Извлеките надосадочную жидкость из пробирки, и соответствующим образом выбросьте ее, так как жидкая фракция может содержать следы радиоактивности. Затем, после сушки на воздухе в течение пяти минут, повторно суспендируйте ее в 200 микролитрах 2X SSC с 0,1% веса на объем SDS.

Используя базу данных геномных тРНК, разрабатывайте ДНК-зонды, сначала извлекая последовательности тРНК или гены, кодирующие тРНК. После обрезки консервативных CCA с тремя простыми концами, если они закодированы, и генерации обратного комплемента, упорядочивают зонды на основе первых 70 нуклеотидов. Чтобы выполнить матричную печать, разморозьте 96-луночную пластину при комнатной температуре.

С помощью алмазной ручки наклейте этикетки на предметные стекла с аминовым покрытием. Затем поместите слайды в блок индексации. Следуя размещению сетки, осторожно опустите штифты репликатора в лунки.

Используя минимальное давление, аккуратно распечатайте массив на стеклянных предметных стеклах. Продолжайте печать без очистки устройства для печати до тех пор A.It пока не закончите с блочным потребуется некоторая практика для стабильной печати. Мы рекомендуем печатать не более восьми-10 массивов за сеанс.

Считайте от 10 до 15 минут на каждый массив. Легко потерять след последовательности печатных шаблонов, поэтому сосредоточьте все свое внимание на задаче и отключите все отвлекающие факторы. Когда будете готовы перейти к следующему блоку, окуните репликатор в 5% отбеливатель и осторожно встряхните.

Вдавите репликатор в впитывающую бумагу. Затем опустите репликатор в дистиллированную воду, осторожно встряхните и прижмите к бумаге. Повторите этот шаг один раз.

Далее окуните репликатор в изопропанол, слегка встряхните и вдавите его в бумагу. Высушите репликатор на вентиляторе в течение примерно 20 секунд, прежде чем перейти к следующему блоку 96-луночного планшета. Продолжайте до нужного количества отпечатков.

Затем дайте предметным стеклам высохнуть. Поместите высушенные предметные стекла лицевой стороной вверх на чистую поверхность в 254-нанометровый УФ-сшиватель. Установите уровень энергии на 999, 990 микроджоулей на квадратный сантиметр, а затем нажмите «Пуск».

Переложите матрицы в 450 миллилитров блокирующего раствора и инкубируйте их при комнатной температуре на магнитной мешалке, при медленном перемешивании в течение ночи. Промойте предметные стекла в 500 миллилитрах дистиллированной воды комнатной температуры, два раза по пять минут каждый. Высушите предметные стекла путем центрифугирования в центрифуге с микрочипом при комнатной температуре в течение 10 секунд.

Храните массивы в сухом и защищенном от света месте до полугода. Перед гибридизацией слайды промыть в кипящей воде и высушить центрифугированием. Поместите матрицу в кассету для гибридизации и загрузите образец радиоактивной РНК.

Прогоните образцы на автоматизированной станции гибридизации-промывки для максимальной воспроизводимости в соответствии с текстовым протоколом. В конце прогона высушите предметные стекла центрифугированием. Оберните горки тонкой пластикой.

Затем используйте счетчик Гейгера на наиболее чувствительной настройке, чтобы проверить предметные стекла на радиоактивный сигнал. Экспонируйте слайды на накопительном люминофорном экране в экспонировании кассеты при комнатной температуре от 10 до 90 часов в зависимости от мощности сигнала. Время воздействия, которое может длиться от нескольких часов до нескольких дней, напрямую зависит от сигнала матрицы.

Требуется некоторая практика, чтобы научиться переводить подсчеты на счетчике Гейгера во время воздействия. Сканируйте предметное стекло с разрешением 50 микрометров с помощью фофоримиджера. Количественное определение и вычитание интенсивности радиоактивности в каждой точке зонда с помощью бесплатного программного обеспечения ImageJ, дополненного профилировщиком микрочипов.

Создание тепловых карт в соответствии с текстовым протоколом. Здесь показаны отсканированные бактериальные, мышиные и человеческие макроматрицы. В массивах M.smegmatis используется всего 43 зонда вместо 48, используемых для мыши и человека.

В результате на бактериальном массиве отображается 40 пустых пятен, которые сливаются с фоном. Три независимые биологические реплики показывают, что в исследуемых условиях роста все тРНК M.smegmatis экспрессируются выше фонового уровня. В данном конкретном эксперименте наблюдаемое стандартное отклонение для каждого зонда составляет от 2% аргинина ТКТ до 22% цистеина ГКА с медианой 5%.

Например, все изоакцепторы аланина экспрессируются на одинаковых уровнях, в то время как самые высокие и самые низкие тРНК, принимающие аргинин, различаются в три раза. После освоения эта техника может быть выполнена примерно за 24 часа, если она выполнена правильно и если сигнал пятна достаточен. Наш метод применим к любым организмам, геном которых доступен для разработки зондов.

Модельные организмы, выращенные in vitro, являются идеальными кандидатами для метаболического мечения. Представленный здесь протокол оптимизирован для Mycobacterium smegmatis, но он также был успешно использован для профилирования тРНК в E.coli, дрожжах, мышах и культивируемых клетках человека. Наша методика воспроизводима и специфична.

Его широкий динамический диапазон и легко регулируемый порог позволяют профилировать малораспространенные вещества, такие как тРНК, связанные с полисомами, просто увеличивая время воздействия матрицы.