Количественная оценка эндогенного ауксинов и цитокининов во время Internode культуры Ipecac

Общая цель этой процедуры состоит в том, чтобы описать, как изменяются уровни эндогенных фитогормонов во время формирования адвентивных побегов у ипекака. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы, связанные с регенерацией тканей в колесе культивирования тканей растений. Основным преимуществом данной методики является то, что эндогенный уровень Индол-3-уксусной кислоты и цитокининов можно просто анализировать с высокой чувствительностью.

Применение этого метода распространяется на все процессы дегенерации тканей растений, поскольку изменения уровня эндогенных фитогормонов вызывают случайное образование побегов. Для начала приготовьте среду B5 без фитогормонов и добавьте 0,2-процентную геллановую камедь. Затем в автоклаве среду простерилизуйте ее.

С помощью хирургического скальпеля на стерильной акриловой пластине нарежьте восьмимиллиметровые междоузлиевые сегменты ростков ипекаки и поместите их на среду. Затем культивируйте сегменты ипекака при температуре 24 градуса Цельсия при 15 микромолях на квадратный метр световой секунды в течение 14-часового светового цикла и 10-часового темного цикла в течение пяти недель. После культивирования сегментов ипекака определите области с первого по четвертый в каждом сегменте.

Раз в неделю с помощью микроскопа подсчитывайте количество придаточных побегов в каждом регионе. Сначала поместите пятимиллиметровый шарик диоксида циркония в четыре двухмиллилитровые пробирки для образцов. Затем с помощью хирургического скальпеля на стерильной акриловой пластине разрежьте сегменты ипекаки на области с I по IV. Затем соберите восемь сегментов из каждой области в одну пробирку для образцов.

Взвесьте каждый из образцов и заморозьте их в жидком азоте. Далее с помощью гомогенизатора на основе гранул измельчите замороженные образцы. Используйте вихревой смеситель для суспендирования образцов в одном миллилитре ацетонитрила с 500 пикограммами каждого внутреннего стандарта волов и КФК.

Поместите образцы на хранение при температуре четыре градуса Цельсия на один час. А затем центрифугируют образцы при 3500 G в течение пяти минут при комнатной температуре. Промойте гранулу в 80-процентном ацеталь-нитриле с одним процентом уксусной кислоты.

Затем повторите центрифугирование и используйте одноразовую пробирку класса для соединения надосадочной жидкости. Добавьте в объединенный надосадочный слой 600 микролитров воды с одним процентом уксусной кислоты. Затем используйте вакуумный концентратор для выпаривания нитрила ацеталя.

Загрузите образцы растворов в отдельные уравновешенные картриджи HLB. А картриджи промыть одним миллилитром воды с одним процентом уксусной кислоты. Затем добавьте ко всем гормонам два миллилитра 80 процентов ацетилнитрила с одним процентом уксусной кислоты в стеклянной пробирке.

С помощью вакуумного концентратора выпарить ацеталь нитрил до получения экстракта в воде с одним процентом уксусной кислоты. Загрузите образцы растворов в отдельные уравновешенные картриджи MCX и промойте картриджи одним миллилитром воды с одним процентом уксусной кислоты. Затем добавьте внутрь стеклянную трубку с двумя миллилитрами 30-процентного ацеталь-нитрила и одним процентом уксусной кислоты.

Затем промойте картриджи двумя миллилитрами 80-процентного ацеталь-нитрила с одним процентом уксусной кислоты. Далее промойте картриджи двумя миллилитрами воды и одним миллилитром воды с пятипроцентным водным аммиаком в вытяжной камере. Проведите КФК в стеклянной трубке с двумя миллилитрами 60-процентного ацеталь-нитрила и пятью процентами водного аммиака в вытяжной камере.

Затем с помощью вакуумного концентратора выпарить растворитель каждой гормональной фракции. Перемешайте образцы при температуре минус тридцать градусов Цельсия до анализа LCMSMS. Сначала растворите каждый гормональный экстракт в пробирке с 600 микролитрами метанола.

Затем перелейте раствор в флакон с винтовым горлышком для полного восстановления и используйте вакуумный концентратор для выпаривания растворителя. Растворите фракцию IAA в 20 микролитрах 30-процентного ацеталь-нитрила, а фракции CK — в 20 микролитрах воды с одним процентом уксусной кислоты. Далее используют тройную квадрупольную систему МС, оснащенную системой ВЭЖХ, для анализа образцов в режиме положительных ионов.

Наконец, количественно оцените эндогенное содержание ИУК в уровнях КФК по сравнению со стандартной кривой соотношения стандартов немеченых и дейтериевых меток. В этом протоколе эндогенный окислитель цитокинин в придаточных желобах измерялся с помощью LCMSMS в течение пяти недель. В первую неделю не образовалось никаких случайных желобов, а первые маленькие желоба появились на второй неделе.

В течение третьей и четвертой недель количество парашютов увеличивалось в основном в первом и втором регентах. В течение пятой недели количество парашютов составляло примерно семь в первом регионе и пять во втором регионе. До появления культуры уровень IAA был немного выше в первом регионе, чем во втором, третьем и четвертом регионах.

В течение первой недели уровень IAA значительно вырос в четвертом регионе и немного снизился в первом, втором и третьем регионах. К пяти неделям культивирования проявился градиент концентрации IAA. С повышением уровня от первого региона к четвертому.

До культивирования у большинства КК были только следовые уровни. В первую неделю уровень tZR увеличился до 13,8 пикограмм на миллиграмм во втором регионе. И 18,1 пикограмма на миллиграмм в третьем регионе.

Напротив, уровни tZ, iP и iPR изменялись лишь незначительно во время культивирования. Пытаясь провести эту процедуру, важно помнить, что эндогенные гормоны стабильны. После того, как она была освоена человеком, эта методика открывает путь для исследователей в области культивирования растительных тканей.

Исследовать случайное образование у других организмов. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как анализировать эндогенную индол-3-уксусную кислоту и цитокинины.