Простая генерация высокой урожайности культуры искусственных нейронов из фибробластов кожи взрослого человека

Общая цель этого протокола заключается в создании высокопродуктивной культуры индуцированных нейронов из фибробластов кожи взрослого человека. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области неврологических расстройств, поскольку он позволяет вызвать дегенерацию нервной системы, основанной на пациенте, которая поддерживает возраст клетки. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет генерировать индуцированные нейроны у людей любого возраста очень стандартизированным и эффективным способом всего за 25 дней.

Он позволяет использовать широкий спектр биомедицинских приложений, включая моделирование заболеваний, токсикологию, диагностику, а также скрининговые анализы на наркотики в очень больших масштабах. Демонстрировать процедуру будут Шелби, аспирант в отделении, где тренируется мозг, а также Карлония, в нашей лаборатории. Для начала разморозьте дермальные фибробласты взрослого человека с помощью автоматизированной системы размораживания клеток.

Подсчитав количество клеток с помощью автоматизированного счетчика клеток, засейте двести тысяч клеток в колбу Т-75, содержащую 10 миллилитров среды фибробластов. Поддерживайте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день замените старую среду на свежую среду фибробластов.

Продолжайте менять среду фибробластов каждые три-четыре дня, пока клетки не достигнут 95% конфлюенции. За час до того, как кожные фибробласты взрослого человека будут перепрограммированы, покройте каждую лунку 24-луночного планшета 250 микролитрами 0,1% желатина. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов по Цельсию.

Отсадите среду фибробластов из колбы и промойте фосфатно-солевой буфером Дульбекко один раз. После промывания лизизируйте клетки 1,5 миллилитрами 0,05%-ного трипсина на колбу Т-75 при температуре 37 градусов Цельсия в течение трех минут. Затем добавьте три миллилитра среды фибробластов для нейтрализации раствора трипсина.

Охладите оторвавшиеся ячейки в 15-миллилитровой пробирке, дважды промыв ячейки в колбе. Затем центрифугируйте клетки при 400 G в течение пяти минут. Изгоните надосадочную жидкость и повторно суспендируйте клеточную гранулу в одном миллилитре среды фибробластов.

Затем приготовьте клеточную суспензию из 1 320 000 клеток в 13,2 миллилитрах среды фибробластов для того, чтобы получить 100 000 клеток на миллилитр среды. После откачки желатина из пластины дважды промойте пластину фосфатно-солевым буфером Дульбекко. Затем добавьте по 500 микролитров клеточной суспензии в каждую из лунок и инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия в течение ночи.

Подогрейте 13,2 миллилитров фибробластов среды до 37 градусов по Цельсию. Затем разморозьте лентивирусный вектор в ламинарном колпаке при комнатной температуре. Добавьте необходимый объем лентивируса, необходимый для инфицирования дермальных фибробластов взрослого человека при кратности инфекции 20, в среду без каких-либо усилителей трансдукции.

Затем замените среду на 500 микролитров среды фибробластов с добавлением лентивирусного вектора. Инкубируйте тарелку при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. На следующий день замените среду, содержащую лентивирус, свежей средой фибробластов без лентивирусного вектора.

На третий день после вирусной трансдукции удалите среду фибробластов и добавьте 500 микролитров среды для ранней конверсии нейронов. Два или три раза в неделю заменяйте 225 микролитров старой среды из каждой лунки на 250 микролитров свежей среды для ранней конверсии нейронов. На 18-й день после вирусной трансдукции удалите среду для ранней конверсии нейронов и замените ее 500 микролитрами среды для поздней конверсии нейронов.

Продолжайте менять среду каждые два-три дня, как и раньше, до 25-го дня или экспериментальной конечной точки. Используйте пипетку объемом 1000 микролитров для удаления среды. Затем добавьте по два 250 микролитров диссоциирующего агента в каждую лунку и оставьте планшет в инкубаторе на 10-20 минут, пока клетки не отделятся и не всплывут как одиночные клетки.

Тем временем подготовьте буфер FACS. Растирать с помощью пипетки объемом 1000 микролитров. Инкубируйте немного дольше, если остались клеточные комки.

Полученную одноклеточную суспензию переложите в пробирку объемом 1,5 миллилитра. Дважды промойте лунки средой позднего преобразования нейронов и переложите в ту же 1,5-миллилитровую трубку. Затем центрифугируйте при 400 G в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость.

Далее повторно суспендируйте клеточную гранулу в 200 микролитрах буфера FACS. Снова уменьшите температуру клеток при 400 G в течение пяти минут и выбросьте надосадочную жидкость. Повторно суспендируйте элементы в буфере FACS и центрифуге.

Повторите еще два раза. Затем повторно суспендируйте клеточную гранулу в 50 микролитрах буфера FACS, содержащего антитела к CD56 человека в концентрации от одного до 50, на 15 минут на льду, вдали от света. Центрифугируйте клетки при 400 G в течение пяти минут и растворите клеточную гранулу в 200 микролитрах буфера FACS для промывки клеток.

Снова центрифугируйте клетки при 400 G в течение пяти минут. Дважды промойте буфером FACS с последующим центрифугированием. Наконец, повторно суспендируйте в 200 микролитрах буфера FACS, содержащего 10 микрограммов на миллилитр йодида пропидия.

Сортируют NCAM-положительные и пропидидо-йодид-негативные клетки с помощью гейтирования на основе уровня интенсивности флуоресценции контрольных образцов, которые не были окрашены антителом NCAM или йодидом пропидия. Используйте автоматический счетчик клеток для подсчета количества клеток и засейте 50 000 клеток на квадратный сантиметр на пластине, покрытой поли-L-орнитином фибронектином и ламинином, с средой позднего преобразования нейронов. Продолжайте менять половину среды два-три раза в неделю с поздней средой для преобразования нейронов до экспериментальной конечной точки.

Репрезентативные фазово-контрастные изображения показывают морфологические изменения в клетках в период конверсии. Значительная трансформация в клеточной морфологии заметна с пятого дня. К 22-му дню примерно половина клеток превратилась в нейроны.

Репрезентативные аминофлуоресцентные изображения показывают наличие стандартных нейрональных маркеров в клетках. К 25-му дню клетки приобретают нейрональную морфологию и экспрессируют нейрональные маркеры, такие как MAP2 и TAU. Ядра окрашиваются DAPI.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее понимание того, как генерировать индуцированные нейроны из фибробластов взрослого человека. И это включает в себя покрытие клеток для перепрограммирования, вирусную трансдукцию, поддержание клеток, а также сортировку FACS для очистки. Разработка этого метода открывает исследователям в области неврологических расстройств путь к изучению различных особенностей, связанных с заболеванием, а также потенциальных методов лечения.

И это может быть сделано в системе, которая является не только нервной системой человека, но и может быть специфичной как для пациента, так и для конкретного заболевания.