Ratiometric кальция изображений отдельных нейронов в себя Caenorhabditis Elegans

Общая цель этой процедуры заключается в проведении ратиометрической кальциевой визуализации влияния специфического нейрона гермафродита, или активности HSN, на поведение Caenorhabditis elegans. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области поведенческой нейронауки о том, как активность нейронных цепей вызывает изменения в поведении животных, когда животные чередуются между поведенческими состояниями. Этот метод позволяет регистрировать изменения внутриклеточной активности кальция с высоким соотношением сигнал/шум, одновременно отслеживая поведение и локомоцию животных.

Хотя этот метод может дать представление об активности нейронов у C.elegans, он также может быть применен к другим прозрачным модельным системам, включая личинки дрозофилы и рыб зебры. Вместе со мной эту процедуру будут демонстрировать студенты Collin's Labs: Ричард Копкок, Прават Дхакал и Лейла Нассар. Чтобы посадить животных, сначала нанесите бактериальный корм OP50 из агаровой пластины с сеяной нематодой на дно медиатора для роста платиновой черви и используйте кирку для переноса приблизительно 20 поздних L 4 L-X 2000 для животных, экспрессирующих чувствительный кальциевый репортер GCaMP5 и mCherry в HSN из промотора N-L трех P на пластину для роста засеянной нематоды.

Подтвердите наличие развивающейся вульвы под стереомикроскопом в виде четкого темного пятна, окруженного белым полумесяцем, и инкубируйте червей при температуре 20 градусов Цельсия в течение 24-40 часов. В конце инкубации нанесите OP50 на новую кирку и перенесите трех червей на незасеянную пластину со средой для роста нематоды, оставив небольшую порцию пищи на новой пластине, чтобы черви могли питаться во время визуализации. Затем с помощью плоского закругленного шпателя отрежьте кусок размером 20 на 20 миллиметров от незасеянной пластины и поместите кусок червячной стороной вниз на один край чистого покровного стекла размером 24 на 60 миллиметров под номером 1,5.

Затем осторожно сдвиньте кусок агара в центр защитного стекла и поместите покровный лист размером 22 на 22 миллиметра номер один на верхнюю часть агара, чтобы уменьшить прилипание и испарение. Чтобы настроить тепловизор, поместите червей на предметное столико инвертированного микроскопа и выберите 20-кратное субъективное значение. С помощью бинокулярных окуляров выберите червячка для визуализации, сдвиньте инфракрасный фильтр и поместите его над конденсатором.

Откройте соответствующую программу анализа видео и запустите сценарий финальной связи последовательного этапа XY. Нажмите на CsvWriter и выберите папку для сохранения записанной информации о сценах X и Y. Затем нажмите на зеленую стрелку, чтобы инициализировать устройство цифрового сбора данных.

В программном обеспечении для записи с инфракрасной камеры в разделе «Настройки» выберите «Переключить диалоговое окно управления камерой». Затем выберите меню «Пользовательские режимы видео» и выберите «Режим 1» и «Формат пикселя Raw восемь». В разделе Ход триггера установите Линию ввода триггера на три, Полярность на высокую и Режим на 14.

Переключите Включить, чтобы остановить захват кадров до тех пор, пока не будет получен сигнал запуска напряжения от флуоресцированной камеры. Открыв окно просмотра изображений, нажмите кнопку Запись и выберите папку для сохранения последовательностей изображений. Выберите режим буферизованной записи и сохраните изображения в формате JPEG.

Затем нажмите «Начать запись», чтобы инициализировать приобретение. Затем откройте вкладку «Захват» в программе Florescence Acquisition и установите время экспозиции на 10 миллисекунд, Биннинг на четыре X и Глубину изображения на 16 бит. Выберите центрированную подматрицу камер размером 512 пикселей в ширину и 256 пикселей в высоту.

Программа автоматически разделит широкое изображение пополам, чтобы сгенерировать отдельные каналы флуоресценции. Нажмите Show Output Trigger Options и установите все триггеры в положительное положение. Убедитесь, что для первого и второго триггеров установлено значение Exposure, а для третьего — Programmable с периодом 25 миллисекунд.

Затем на вкладке «Последовательность» выберите «Таймлапс» в разделе «Настройки сканирования», установите «Задержка поля» от одного до 50 миллисекунд для сбора изображений с частотой 20 герц. Выберите «Сохранить во временном буфере». Для ратиометрической визуализации кальция на вкладке «Последовательность» нажмите «Старт», чтобы начать запись и отслеживание червя с помощью джойстика, удерживая клетки и синапсы интереса в фокусе в центре поля зрения.

В момент начала записи флуоресценции триггеры отправляются на ожидающую камеру яркого поля и контроллер сцены, которые начинают собирать синхронизированные изображения и положение сцены. Нажмите кнопку «Статистика» в окне «Гистограмма», чтобы отобразить статистику по пикселям для каждого канала. Отрегулируйте мощность светодиода так, чтобы максимальный один пиксель mCherry флоресценции на пресинаптическом конце был больше или равен 8 000 отсчетов в красном канале, что дает примерно 12-битный динамический диапазон над фоном.

Репортерные сигналы кальция на пресинаптическом конце во время покоя или при низком уровне кальция должны составлять около 2500 отсчетов в зеленом канале. Записывайте поведение до тех пор, пока не будет достигнуто активное состояние кладки одного яйца. Затем сохраните 10-минутное подмножество, содержащее 6 000 кадров до и 6 001 кадр после первого события откладывания яиц.

Позаботьтесь о том, чтобы сохранить одно и то же подмножество изображений яркого поля поведения червя и временных точек положения X-Y ступени, иначе точная синхронизация потоков данных будет потеряна. Для сегментации изображений импортируйте последовательности изображений в соответствующую программу ратиометрического квантования и щелкните правой кнопкой мыши временной ряд на вкладке последовательности, чтобы установить временной ряд равным 20 кадрам в секунду и 1,25 микрометра на пиксель. В меню «Инструменты» выберите «Соотношение», затем выберите mCherry для канала A и GCaMP5 для канала B и нажмите «Рассчитать», чтобы вычесть фон из каждой последовательности изображений.

Выберите Применить радужную таблицу преобразования к каналу отношения и используйте канал mCherry для создания канала отношения с модуляцией интенсивности, чтобы сопоставить цвет отношения с яркостью канала mCherry. Нажмите кнопку Ratio (Ratio), чтобы создать два канала. Чтобы создать протокол поиска объектов, перетащите инструмент Найти объекты с помощью интенсивности на вкладке измерений на панель протокола и щелкните по шестеренке, чтобы установить окно значений интенсивности mCherry и выбрать пункт Найти объекты.

Выбирайте значения интенсивности, превышающие или равные двум стандартным отклонениям над фоном, заботясь об обнаружении тела клетки и пресинаптического конца. Добавляйте любые дополнительные фильтры, нацеленные на канал mCherry, только по мере необходимости, чтобы исключить нежелательные объекты, такие как: голова, хвост или цветение кишечника. Затем откройте меню «Измерения» и выберите пункт «Сделать измерение», а затем выберите все временные точки для выполнения протокола анализа квантования изображения.

Одновременный сбор сигналов GCaMP5 и mCherry используется для создания канала соотношения пикселей на пиксели, который компенсирует изменения в движении и фокусе животного. Для каждого животного изменения пресинаптического внутриклеточного кальция HSN могут коррелировать с поведением, очевидным на визуализации в ярком поле, включая высвобождение яиц и изменения в локомоции. Действительно, можно наблюдать значительные различия в скорости червя до, во время и после активной фазы яйцекладки.

Если увеличить масштаб одного события яйцекладки, то можно увидеть значительное изменение цветения GCaMP5 перед началом яйцекладки. В то время как цветение mCherry остается относительно неизменным. Кроме того, измеренные изменения в соотношении GCaMP5:mCherry ясно показывают переходный процесс кальция HSN примерно за 4 секунды до выхода яйцеклетки.

Происходит сокращение мышц вульвы, что проявляется в явном замедлении локомоции червя, которое заканчивается высвобождением яйцеклетки. Кроме того, визуализация и отслеживание червей, как показано выше, позволяет визуализировать пространственную организацию поведения при откладывании яиц от кормления, преходящих изменений кальция HSM и активности HSN, которая переходит в взрывное возбуждение перед перемещением к месту кладки яиц. После освоения этой техники ее можно завершить за час или два, если она выполнена правильно.

Пытаясь выполнить эту процедуру, важно помнить о необходимости сохранять фокус на интересующих клетках и их пресинаптических окончаниях во время этапов визуализации. После этой процедуры могут быть применены другие методы, такие как оптогенетическая активация, чтобы ответить на дополнительные вопросы о том, как HSN реагирует на пресинаптическую стимуляцию. Этот метод проложил путь исследователям в области нейробиологии к изучению функции схемы откладывания яиц у C.elegans.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить ратиометрическую визуализацию кальция HSN при активном Caenorhabditis elegans.