Используя систему обогащения всеобъемлющего иммунопреципитации для определения профиля эндогенных столб-поступательные изменения целевых белков

Общая цель этого экспериментального протокола состоит в том, чтобы позволить неопытным исследователям ПТМ эффективно определить, эндогенно ли их целевой белок модифицируется одним или несколькими ПТМ с использованием единой комплексной системы. Этот метод улучшит исследование области посттрансляционной модификации, позволяя обнаруживать ключевые PTM и потенциальные перекрестные помехи для любого целевого белка с помощью единой упрощенной системы. Основное преимущество этого метода заключается в том, что эксперты, не занимающиеся ПТМ, могут определить, эндогенно ли модифицирован белок одним или несколькими ПТМ в их модельной системе.

Впервые идея этого метода пришла нам в голову, когда мы изучали регуляторные механизмы для нескольких клеточных сигнальных путей, и обнаружили, что наши удобные наборы или системы на самом деле недоступны для изучения нефосфосодержащих ПТМ. Начните эту процедуру с подготовки клеток A431, как описано в текстовом протоколе. Также готовят лизис бластера в буферах разведения с ингибиторами.

Слейте питательную среду, а клетки поместите на лед. Затем дважды промойте клетки 10 миллилитрами 1x фосфатного буферного раствора. Удалите как можно больше PBS перед добавлением буфера для лизиса бластера для максимального лизиса клеток.

Добавьте 600 микролитров буфера для лизиса бластера на каждую 150-миллиметровую пластину. Количество буфера основано на ожидаемом выходе белка. Далее лизируйте клетки с помощью скребка для клеток.

Лизат станет вязким из-за лизиса ядра. С помощью отрезанного наконечника для дозатора диаметром в один миллиметр неочищенный лизат переносится в фильтр бластера, помещенный в 15-миллилитровую пробирку для сбора. Используйте прилагаемый поршень фильтра, чтобы полностью сжать фильтр бластера и собрать проточный лизат, включая любые пузырьки, в 15-миллилитровую трубку.

Простой и эффективный бластерный фильтр удаляет геномную ДНК, а не срезает ее, как это происходит при других широко используемых методах. Осветленный лизат разбавить бластером до конечного объема три миллилитра на каждую 150-миллиметровую пластину. Окончательный объем основан на ожидаемом выходе белка.

Этот шаг важен, так как конечный состав буфера будет влиять на жесткость реакции осаждения аминов. Далее приготовьте анализ для количественного определения белка, как описано в текстовом протоколе. Измерьте поглощение образца лизата на 600 нанометрах и рассчитайте концентрацию белка.

Переверните штатную трубку с реагентом несколько раз, чтобы убедиться, что шарики полностью ресуспендированы в трубке. Для каждого анализа ВП гранулированную суспензию разложить по отдельным 1,5 миллилитровым микроцентрифужным пробиркам на льду. Здесь добавьте 20 микролитров аффинных гранул убиквитина, 30 микролитров аффинных гранул фосфотирозина, 40 микролитров аффинных гранул SUMOylation 2/3 или 50 микролитров аффинных гранул ацетилирования в отдельные микроцентрифужные пробирки.

Переверните стандартные пробирки с реагентами, содержащие убиквитинирующие контрольные шарики IP и контрольные бусины IGG, несколько раз, чтобы убедиться, что шарики полностью ресуспендированы в пробирке. Затем распределите контрольные бусины для каждой контрольной реакции, чтобы определить неспецифическое связывание. Здесь добавьте 20 микролитров контрольных шариков убиквитина, 30 микролитров контрольных шариков фосфотирозина, 40 микролитров контрольных шариков SUMOylation 2/3 или 50 микролитров контрольных шариков ацетилирования в отдельные 1,5-миллилитровые микроцентрифужные пробирки на льду.

Сохраните 20 микролитров лизата для запуска в качестве контроля входного лизата вестерн-блоттинга. Добавьте пять микролитров 5-кратного буфера для образцов к зарезервированному лизату и кипятите при температуре 95 градусов Цельсия в течение пяти минут. Далее добавьте лизат в каждую IP-трубку и контрольную IP-трубку.

Здесь один миллиграмм лизата был использован на каждую реакцию IP и контрольную реакцию, в результате чего в общей сложности было проведено восемь реакций IP. Инкубируйте пробирки на вращающейся платформе при температуре четыре градуса Цельсия в течение двух часов. После инкубации соберите шарики центрифугированием при температуре от трех до 5 000 G в течение одной минуты при четырех градусах Цельсия.

Удалите как можно больше надосадочной жидкости, не повреждая шарики, затем промойте шарики в одном миллилитре буфера для промывки бластера в течение пяти минут на вращающейся платформе с температурой 4 градуса Цельсия и соберите шарики центрифугированием, как и раньше. После центрифугирования отасуньте как можно больше надосадочной жидкости, не потревожив шарики, и повторите этап промывки еще два раза. После окончательной промывки и центрифугирования аспирируйте большую часть в буферной надосадочной жидкости, затем удалите остаточную надосадочную жидкость с помощью тонкокоротечного наконечника для загрузки белка.

Минимальное разрушение гранул гранул допустимо. Убедитесь, что весь буфер для промывки был удален, сведя к минимуму разрушение гранул для взбивания, чтобы максимально восстановить белки PTM. Затем добавьте 30 микролитров буфера для элюирования шариков и повторно суспендируйте шарики, слегка постукивая или щелкая стороной трубки.

На этом этапе не используйте пипетку. Инкубируйте ресуспензионные бусины при комнатной температуре в течение пяти минут. Отрежьте конец наконечника переводного пипетки и аккуратно перенесите каждую суспензию шариков в спиновую колонку микроцентрифуги объемом 1,5 миллилитра, помещенную в микроцентрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитров.

Центрифугируйте образец при температуре от 9 до 10 000 раз G от одной минуты при комнатной температуре, чтобы собрать образец IP, затем добавьте два микролитра 2-меркаптоэтанола в каждый образец и хорошо перемешайте. Поместите образцы на водяную баню при температуре 95 градусов Цельсия на пять минут. После инкубации соберите образец центрифугированием при 10 000 G в течение одной минуты при комнатной температуре.

Наконец, перейдите к запуску SDS PAGE, переносу и анализу вестерн-блоттинга, как описано в текстовом протоколе. Необработанный и обработанный EGF лизат клеток A431 добавляли к убиквитину, фосфотирозину, SUMO 2/3 и аффинным гранулам ацетиллизина. Антитело PD-L1 было использовано для вестерн-иммуноблоттинга, чтобы определить, модифицировался ли белок PD-L1 этими четырьмя PTM в ответ на стимуляцию EGF.

Представленные здесь репрезентативные результаты указывают на то, что этот метод эффективно идентифицирует эндогенные модификации ПТМ PD-L1. После освоения этой техники ее можно выполнить за четыре-четыре с половиной часа, если она выполнена правильно. После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее представление о том, как обнаружить эногенную ПТМ или перекрестные помехи для целевого белка или сигнального пути с помощью этой комплексной системы обнаружения ПТМ.