Геном всей RNAi скрининг для выявления факторов хоста, которые модулируют вирус онколитического терапии

Общая цель этого протокола состоит в том, чтобы определить мишени хозяина, которыми можно манипулировать для усиления онколитической вирусной терапии. Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы в области терапии онколитических вирусов, например, какие специфические факторы хозяина и клеточные пути модулируют репликацию онколитического вируса. Основное преимущество этого метода заключается в том, что он позволяет идентифицировать мишени хозяина, которыми можно манипулировать для усиления онколитической вирусной терапии всесторонним и непредвзятым образом.

Этот протокол также может быть использован для идентификации факторов хозяина, которые модулируют репликацию вируса в целом. После разработки высокопроизводительного скринингового анализа в соответствии с текстовым протоколом достаньте партию микротитровых планшетов из морозильной камеры и дайте им разморозиться в течение 20-30 минут. Тем временем наполните две бутылки 70% этанолом, затем заполните две конические пробирки объемом 50 мл PBS и одну дистиллированной водой.

Погрузите трубку дозатора жидкости в бутылку с 70% этанолом, затем наклейте на трубку кусок малярной ленты, чтобы отметить точку, ниже которой трубку можно считать стерильной. Используйте примерно 25 мл 70% этанола для заливки трубки. Налейте в бутылку еще этанола, чтобы восполнить потерянный объем, затем дайте трубке постоять в этаноле не менее пяти минут.

После подготовки колпака для клеточных культур центрифугируйте запечатанные планшеты и схватывают при 1026-кратном G при комнатной температуре в течение двух минут. Далее снимаем пломбы с пластин. Затем пипеткой наберите необходимое количество реагента для трансфекции в конические пробирки, содержащие предварительно подогретый разбавитель реагента для трансфекции.

Начните трипсинизацию клеток с аспирации среды из каждой пластины. Используйте девять мл PBS для промывки клеток, затем пипеткой три мл трипсина на пластину. Инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия в течение примерно пяти минут.

Затем используйте 22 мл среды для ресуспендирования клеток, пипетируя вверх и вниз 10 раз. Соедините клеточную суспензию из каждого планшета для культуры тканей в стерильную бутылку и перемешайте клеточную суспензию, перевернув бутылку. Затем пипеткой ввели один мл аликвата в клеточную суспензию в две отдельные микрофуговые пробирки.

Извлеките образец из каждой микрофуговой пробирки и подсчитайте клетки. Затем рассчитайте объем клеточной суспензии, необходимый для требуемой плотности, и приготовьте достаточное количество разбавленной клеточной суспензии для распределения по одной партии планшетов. Пока элементы готовятся, опорожните трубку дозатора жидкости от этанола.

Используйте примерно 25 мл PBS для заливки трубки, а затем опорожните трубку. Убедитесь, что часть трубки, которая будет погружена в реагент для трансфекции, а затем в клеточную суспензию, остается стерильной. Разложите пластины, что можно безопасно сделать с помощью одной конической трубки раствора реагента для трансфекции.

Пипеткой растворы трансфекционных реагентов вверх и вниз 10 раз. Затем используйте раствор для грунтовки трубки перед выдачей 5 микролитров на лунку. Центрифугируйте планшеты при 1026 умноженных на G при комнатной температуре в течение одной минуты.

Затем инкубируют планшеты при комнатной температуре в течение времени, предусмотренного для используемого реагента для трансфекции. Во время инкубации опорожните трубку от раствора трансфекционного реагента и поместите его в полную коническую пробирку объемом 50 мл, содержащую PBS. Затем используйте примерно 25 мл PBS для промывки трубки, загрунтовав и опорожнив ее.

Смешайте флакон с клеточной суспензией, затем поместите трубку в суспензию и загрунтуйте трубку достаточно, чтобы убедиться, что каждый наконечник дозируется правильно. Распределите по 30 микролитров на лунку клеточной суспензии на все планшеты. Опорожните клеточную суспензию из трубки, затем промойте трубку примерно 25 мл PBS, а затем примерно 50 мл дистиллированной воды.

Дайте пластинам постоять при комнатной температуре от 45 до 60 минут с момента посева ячеек. Затем инкубируйте планшеты в непотревоженном инкубаторе до желаемой продолжительности подавления генов. Чтобы сэкономить время, за день до заражения клеток нанесите пипеткой в стерильные флаконы точное количество среды, необходимое для заражения каждой партии планшетов, включая среду для неинфицированных лунок.

Нагрейте среду до 37 градусов по Цельсию, затем наполните две бутылки 70% этанолом, две конические пробирки объемом 50 мл с PBS и одну дистиллированную воду. Простерилизуйте трубки с помощью 70% этанола, как было показано ранее. Пока трубка находится в этаноле, сначала нагнетайте вирус, а затем пипеткой точный объем вируса в бутылку с инфекционной средой.

Затем промойте трубку, используя 25 мл PBS, чтобы заправить ее, а затем опорожните. После извлечения планшетов из инкубатора поместите их в колпак для культуры тканей. Используйте среду для заливки трубок, затем налейте 40 микролитров среды в незараженные контрольные лунки.

Опорожните трубку от среды и используйте 25 мл PBS для ее промывки. После смешивания вируса поместите трубку в бутылку с вирусом, распределите 40 микролитров вируса по тарелкам. Центрифугируйте планшеты при 400-кратном перегрузке при комнатной температуре в течение 30 минут.

Инкубируйте пластины в течение заранее определенного периода времени. За день до фиксации приготовьте флакон с фиксирующим и стоячим раствором, содержащим четырехпроцентный формальдегид и PBS, для каждой партии пластин, но опустите морилку Hoechst. Храните раствор в легковоспламеняющемся шкафу вдали от света.

На следующий день используйте 70% этанол и PBS для промывки трубки, как было показано ранее. Распределите по 30 микролитров раствора по всем пластинам, затем поместите пластины в инкубатор на 30 минут. После инкубации нанесите уплотнения на пластины и храните их при температуре четыре градуса Цельсия в защищенном от света месте.

Проведите визуализацию и анализ в соответствии с текстовым протоколом. Здесь показано 786 О-клеток, окрашенных Hoechst 33342 после 72-часовой инкубации только разбавителем реагента для трансфекции. Трансфекционный реагент и разбавитель, нецелевые миРНК, а также миРНК, нацеленные на PLK1.

Показанный здесь график выживаемости показывает, что 22% клеток, трансфицированных миРНК PLK1, выжили, а 94% клеток, трансфицированных нецелевыми миРНК, выжили. На этом графике представлены результаты жизненного цикла 786 О-клеток, инфицированных онколитическим вирусом коровьей оспы, экспрессирующих повышенный GFP при различных MOI. Здесь представлены репрезентативные изображения клеток, инфицированных при MOI 0,05 в течение реального времени.

Инкубационный период продолжительностью 21 час позволит обнаружить увеличение и уменьшение распространения, поскольку временная точка находится в линейном диапазоне. После полногеномного скрининга РНК-интерференции по трем опухолевым клеточным линиям, с помощью метода MAD было идентифицировано 1008 попаданий, общих по крайней мере для двух из трех линий раковых клеток. 10 попаданий в пути UPR и ERAD были отобраны для вторичной валидации с помощью миРНК с различными последовательностями-мишенями.

При дозировании реагентов крайне важно, чтобы у вас была правильная партия планшетов, был выбран правильный объем для диспенсирования, а также чтобы трубка была заполнена правильным реагентом и всегда полностью погружена в реагент. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как проводить высокопроизводительный скрининг РНК-интерференции для выявления мишеней хозяина, которыми можно манипулировать для усиления онколитической вирусной терапии, или для выявления факторов хозяина, которые модулируют репликацию вируса в целом.